摘 要 目的：制备序列为丙氨酸-谷氨酸-酪氨酸-亮氨酸-精氨酸（简称为“AEYLR”）的小肽修饰的紫杉醇（PTX）纳米结构脂质载体（A-P-NLC），并对其体内外抗肿瘤效果进行评价。方法：采用熔融乳化-低温固化法制备纳米结构脂质载体（NLC）、PTX纳米结构脂质载体（P-NLC）和A-P-NLC，表征其外观形态、粒径、多分散指数（PDI）、Zeta电位，并检测其包封率、载药量及体外释放度；以NCI-H1299细胞和S180细胞为对象，采用CCK-8法对游离PTX、P-NLC、A-P-NLC（0.44～44.00 μg/mL，以PTX计）的细胞抑制作用进行考察，并计算其半数抑制浓度（IC50）；以S180荷瘤小鼠为模型动物，对游离PTX、P-NLC、A-P-NLC（5 mg/kg，以PTX计）的抑瘤效果进行评价。结果：P-NLC和A-P-NLC外观均呈类圆形、分布均匀；A-P-NLC的粒径、PDI、Zeta电位分别为（43.92±0.76）nm、0.203±0.034、（－19.77±1.16）mV，较P-NLC有所增加；A-P-NLC的包封率、载药量分别为（95.71±0.68）％、（1.97±0.25）％，较P-NLC有所降低；A-P-NLC在48 h内累积释放百分率达（35.17±2.08）％，较游离PTX表现出明显的缓释作用，且比P-NLC的释放更缓慢。与游离PTX和P-NLC比较，相同质量浓度的A-P-NLC对NCI-H1299细胞和S180细胞的抑制率大部分均显著升高，IC5值均显著降低；A-P-NLC给药处理的S180荷瘤小鼠无死亡现象，一般状态良好，且瘤体积显著缩小、瘤质量显著降低、瘤质量抑制率显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。结论：A-P-NLC具有明显的缓释作用，其对NCI-H1299细胞和S180细胞的体外抑制作用以及对小鼠S180实体瘤的抑制作用均优于游离PTX和P-NLC，且毒性有所降低。

紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是从红豆杉中提取的一种四环二萜类化合物，在临床上主要用于乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌等的一线/二线治疗；其常规剂型为溶液型注射剂，但该类剂型含有的增溶剂聚氧乙烯蓖麻油会引起过敏反应，故将其制备成各种纳米制剂以降低其毒性已成为研究热点[1-4]。纳米结构脂质载体（Nanostructrued lipid carriers，NLC）是采用单甘油酯、双甘油酯、其他类甘油酯、磷脂、鞘脂类等脂质为载体，并添加一定比例的液态油，将药物吸附或包裹于脂质核中而形成的脂质纳米给药系统[5-6]。NLC具有良好的生物相容性，适于静脉注射、口服等多种途径给药[7-8]，具有极大的潜在应用价值。序列为丙氨酸-谷氨酸-酪氨酸-亮氨酸-精氨酸（Ala-Glu-Tyr-Leu-Arg，简称为“AEYLR”）的小肽来自于表皮生长因子受体（EGFR）自磷酸化位点 Y1173，前期研究已证明其对 EGFR 高表达的肿瘤具有良好的体内外靶向性[9-10]。为降低抗肿瘤药物的毒性并提高其靶向性，本课题组将 PTX 制成 AEYLR 小肽修饰的 NLC（简称为“A-P-NLC”），对其进行表征，并对其体内外抗肿瘤效果进行评价，为 PTX 抗肿瘤制剂的进一步开发提供实验基础。

 1材料

AL204型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；HT7700 型透射电子显微镜（日本Hitachi公司）；Zetasizer Nano-ZS90型纳米粒径电位分析仪（英国Malvern公司）；ZHWY-200D型恒温培养振荡器（上海智城分析仪器有限公司）；2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；5804R型台式高速大容量离心机（德国 Eppendorf 公司）；3111 型细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；Tecan Safire 2型酶标仪（瑞士Tecan公司）；ARZ型电子数显游标卡尺（宁波市鲁匠工具有限公司）；MD44MM透析袋（美国Viskase公司，截留分子量：8 000～14 000 Da）。

PTX对照品（，批号：17022701，纯度：≥98％）；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000-AEYLR（DSPE-PEG2000-AEYLR，广州特立生物科技有限公司，批号：GT60304-0324-A，纯度：≥90％）；CCK-8试剂盒（碧云天生物技术有限公司，批号：20332）；山嵛酸甘油酯（ATO，法国Gattefossé公司）；单硬脂酸甘油酯（GMS，马来西亚KLK公司）；中链三酰甘油（MCT，北京凤礼精求商贸有限公司）；聚氧乙烯35蓖麻油（ELP）、聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯（HS15）（德国BASF 公司）；RPMI 1640培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；聚山梨酯80（美国Sigma公司）；pH 7.4磷酸盐缓冲液（PBS，由北京酷来博科技有限公司的固体粉末产品用超纯水配制）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为纯化水或超纯水。

人非小细胞肺癌细胞NCI-H1299、小鼠腹水瘤细胞S180均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

SPF级昆明小鼠50只（雌性30只、雄性20只），体质量 18～22 g，购于哈尔滨医科大学实验动物学部，生产许可证号：SCXK（黑）2013-001。所有动物均饲养于SPF级实验室，环境温度为 18～22 ℃、湿度为 50％～60％，饲喂清洁级真空包装小鼠饲料。

2 方法与结果

采用熔融乳化-低温固化法进行制备。称取 ATO40 mg、GMS 13 mg、MCT 27 mg、ELP 54 mg 作为油相，另称取/量取 HS15 54 mg、水 4 mL 作为水相，将油相和水相分别置于 80 ℃水浴中熔融或溶解；在恒温磁力搅拌下，将油相缓慢滴入水相，待滴加完成，继续乳化 10min；随后将油水混合物迅速置于冰水浴中固化15 min，再分别经0.45 μm、0.22 μm微孔滤膜滤过后，即得NLC溶液。另外，先单独将 5 mg/mL 的 PTX 无水乙醇溶液200 μL（挥干乙醇）或与DSPE-PEG2000-AEYLR 8 mg同时加入上述油相中，再按同样的操作方法分别制得PTX纳米结构脂质载体（P-NLC）溶液和修饰有AEYLR小肽的 PTX 纳米结构脂质载体（A-P-NLC）溶液。3 种 NLC样品溶液均显蓝色乳光。

采用高效液相色谱（HPLC）法测定PTX含量。色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（55 ∶ 45，V/V）；流速为 1 mL/min；柱温为 25 ℃；检测波长为 227 nm；进样量为 20 μL[11]。精密称取 PTX 对照品适量，以流动相制成质量浓度分别为5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL的系列标准溶液，按上述色谱条件测定；以 PTX 的峰面积（A）对质量浓度（c，μg/mL）进行线性回归，得标准曲线方程为A＝0.558 5c+0.910 7（r＝0.999 8）。结果表明，PTX 的质量浓度在5.0～100.0 μg/mL范围内线性关系良好。

采用超滤离心法[12]测定样品的载药量和包封率。取“2.1”项下制备的 P-NLC 样品溶液适量，置于超滤离心管（截留分子量：10 kDa，下同）中，10 000 r/min 离心40 min，收集下清液，经甲醇适当稀释后，按上述色谱件进样测定，得游离药物含量（W 游离）；另取P-NLC样品溶液适量，置于离心管中，经乙腈破乳后，3 000 r/min 离心20 min，取上清液，按上述HPLC色谱条件进样测定，得总药物含量（W 总）。按照公式计算 P-NLC 的载药量（DL）和包封率（EE）：DL（％）＝（W 总 －W 游 离）/W 脂 质 ×100％，EE（％）＝（W 总－W 游离）/W 总×100％；式中，W 脂质为处方中液态脂质和固态脂质的总量[13]。另取“2.1”项下制备的A-P-NLC样品溶液适量，同法测定。试验均重复3 次 。结 果 ，P-NLC 和 A-P-NLC 的 载 药 量 分 别 为（99.13 ± 0.86）％ 、（95.71 ± 0.68）％ ，包 封 率 分 别 为（2.33±0.15）％、（1.97±0.25）％，A-P-NLC 的载药量和包封率较P-NLC均有所降低。

取游离PTX和“2.1”项下制备的P-NLC和A-P-NLC样品溶液适量，采用透析法[13]模拟药物释放过程，设置截留分子量为10 kDa、释放介质为含0.2％聚山梨酯80的PBS，于0、2、4、6、8、10、12、24、48 h时取样，按“2.3”项下 HPLC 法测定 PTX 质量浓度，考察其体外释放度，并按公式计算累积释放百分率：累积释放百分率（％）＝[V0×Ct+V（C1+C2+C3+……+Ct－1）]/m×100％，其中，m是加入制剂含药总量，V是每次取样体积，V0是释放介质的总体积，C1、C2、C3……Ct分别是第1、2、3……t取样时间点的浓度。试验均重复3次。结果显示，游离PTX在12 h时的累积释放率已达到（90.00±2.33）％，而 P-NLC、A-P-NLC 在 48 h 时的累积释放百分率分别为（43.053.74）％、（35.17±2.08）％；与游离 PTX 比较，P-NLC 和A-P-NLC 均表现出明显的缓释作用，且 A-P-NLC 较P-NLC的释放更缓慢，详见图3。

2.5.2 不同PTX样品的细胞抑制作用 按“2.5.1”项下方法取细胞接种并培养，分为对照组（细胞+培养基）和各药物组（细胞+游离PTX或P-NLC或A-P-NLC的含药培养基，所含 PTX 的终质量浓度均分别为 0.44、1.10、4.40、11.00、44.00 μg/mL）；另设不含细胞的空白组（培养基），每组设置6个孔。剂量均根据预试验结果设置。按照“2.5.1”项下方法培养并测定各孔OD值，并按公式计算细胞抑制率：细胞抑制率（％）＝（OD 药 物 组 －OD 空 白 组）/（OD 对照组－OD 空白组）×100％。采用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验（P＜0.05为差异有统计学意义）；同时，计算药物的半数抑制浓度（IC50）。

2.6.1 S180荷瘤小鼠模型建立 取对数生长期的S180细胞，以4 ℃生理盐水漂洗并调节细胞浓度至1×107个/mL，按200 μL/只接种于小鼠（雌性10只）的腹腔[14]。4～5 d后可见小鼠腹部凸起、明显增大，此时取其S180腹水瘤细胞用于传代[13]。传至第3代后，抽取腹水瘤模型小鼠的腹水，以 4 ℃生理盐水漂洗并调节细胞浓度至 1×108个/mL，另取小鼠（雌雄各20只），按200 μL/只注射至其腋窝皮下，并观察其腋窝处实体瘤形成情况。当小鼠腋窝处出现小的突起且触摸有硬结感时，即为荷瘤造模成功。

2.6.2 A-P-NLC 的体内抗肿瘤作用考察 取“2.6.1”项下造模成功的荷瘤小鼠 32 只，随机分为对照组、游离PTX组、P-NLC组、A-P-NLC组，每组8只。各组小鼠均尾静脉给药100 μL/次，隔天1次，连续8次。除对照组给予生理盐水外，各给药组的给药剂量均以5 mg/kg PTX计算，剂量根据预试验结果设置。每天观察小鼠一般状态，并测量其体质量；以游标卡尺测量肿瘤垂直方向上的长径（a）和短径（b），计算肿瘤体积（V＝ab2/2）[15]；末次给药24 h后处死小鼠，剖取肿瘤，称定瘤质量，并按公式计算瘤质量抑制率：瘤质量抑制率（％）＝（1－给药组瘤质 量/对 照 组 瘤 质 量）× 100％ [16]。统计学方法同“2.5.2”项。

各组小鼠瘤体积均随时间延长而呈增加趋势；与对照组比较，各给药组小鼠自给药3 d时起瘤体积均显著缩小，P-NLC组和A-P-NLC组小鼠在末次给药后24 h时瘤质量均显著降低；与游离 PTX 组比较，P-NLC 组和A-P-NLC 组小鼠分别自给药 7、5 d 时起瘤体积显著缩小，在末次给药后24 h时瘤质量显著降低、瘤质量抑制率显著升高；与P-NLC组比较，A-P-NLC组小鼠自给药7 d时起瘤体积显著缩小，在末次给药后24 h时瘤质量显著降低、瘤质量抑制率显著升高。以上差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），详见表2、表3。

3 讨论

经 PEG 修饰的 NLC 可通过“高渗透、长滞留”效应被动靶向进入肿瘤组织，即通过肿瘤微血管的空隙渗漏进入肿瘤组织，但进入肿瘤组织的NLC因其表面修饰有PEG 故亲水性增强，会使其跨膜进入细胞受到影响；AEYLR 小肽对 EGFR 具有特异的靶向性，可使连接有AEYLR的NLC对EGFR高表达的细胞及肿瘤组织具有主动靶向作用，同时还可通过EGFR受体介导肿瘤细胞对NLC的内吞，提高NLC的入胞量[9-10]。

DSPE-PEG2000-AEYLR 是 AEYLR 通过 PEG 末端活化技术连接在 DSPE-PEG2000 末端的产物。本研究采用熔融乳化-低温固化法制备 A-P-NLC，在乳化过程中DSPE-PEG2000-AEYLR结构中的亲水部分PEG2000-AEYLR存在于乳滴表面，而在低温固化后AEYLR部分即被修饰到了P-NLC的表面。与P-NLC比较，A-P-NLC在制备过程中加入了 DSPE-PEG2000-AEYLR，增加了NLC表面PEG的量，导致粒径、粒度分布及Zeta电位绝对值均有所增长，同时空间位阻的增加使其包封率和载药量略有降低；二者的体外释放行为相似，均有缓释效果，但 A-P-NLC 的缓释效果更为明显，可能是由于DSPE-PEG2000-AEYLR的加入使P-NLC的结构变得更加稳定，从而使药物释放更缓慢。

本研究选择 EGFR 高表达的人非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299和鼠源S180细胞系[17-18]作为模型细胞，主要考察了 A-P-NLC 对两种肿瘤细胞的体外抑制效果。结果显示，与游离PTX和P-NLC比较，加入了具有主动靶向作用的AEYLR后，A-P-NLC显示出更强的体外肿瘤细胞抑制效果。而进一步采用S180细胞建立小鼠荷瘤模型并进行体内抑瘤作用考察的结果显示，与游离PTX组和P-NLC组比较，A-P-NLC组小鼠的瘤体积、瘤质量均显著缩小或降低，瘤质量抑制率均显著升高；另外，游离 PTX 组有 3 只小鼠由于 PTX 的长期毒性而死亡，而P-NLC组与A-P-NLC组小鼠死亡情况减少，且体质量较游离PTX组显著增长，提示PTX制成NLC后可减小药物的毒副作用，提高用药安全性。

综上，A-P-NLC 具有明显的缓释作用，其对 NCIH1299 细胞和 S180 细胞的体外抑制作用以及对小鼠S180 实体瘤的抑制作用均优于游离 PTX 和 P-NLC，且毒性有所降低。

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