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单标记修饰

        多肽荧光标记由于没有放射性,实验操作简单。因此,目前在生物学研究中多肽荧光标记应用非常广泛,多肽荧光标记方法与荧光试剂的结构有关系,对于有游离羧基的采用的方法与接多肽反应相同,也采用HBTU/HOBt/DIEA方法连接。 在N端标记FITC的多肽需经历环化作用来形成荧光素,通常会伴有最后一个氨基酸的去除,但当有一个间隔器如氨基己酸,或者是通过非酸性环境将目的多肽从树脂上切下来时,这种情况可避免在切割的过程中被TFA切割掉。



    1、什么是荧光标记?



        荧光标记所依赖的化合物称为荧光物质。荧光物质是指具有共轭双键体系化学结构的化合物,受到紫外光或蓝紫光照射时,可激发成为激发态,当从激发态恢复基态时,发出荧光。荧光标记技术指利用荧光物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上,利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。荧光标记的无放射物污染,操作简便等优点,使得荧光标记物在许多研究领域的应用日趋广泛。


    2、荧光标记的作用


    荧光标记物质在蛋白的功能研究、药物筛选等领域也有着广泛的应用。人们利用利用荧光标记的多肽来检测目标蛋白的活性,并将其发展的高通量活性筛选方法应用于疾病治疗靶点蛋白的药物筛选和药物开发(例如,各种激酶、磷酸酶、肽酶等)。因此,多肽的荧光修饰,同样是多肽合成领域的重要内容。


    3、荧光标记的位点


    荧光标记物质可以直接和多肽的N端直接相连(如异硫氰酸荧光素的连接, 通常在多肽的N端和异硫氰酸荧光素直接插一个氨基乙酸或者β-丙氨酸。),或者在C端和赖氨酸(或半胱氨酸)的侧链连接、或者在其它可以连接的位子连接。


    4、荧光标记的举例


    4.1 荧光标记FITC修饰


    异硫氰酸荧光素(FITC)具有比较高的活性,通常来说,在固相合成过程中引入该种荧光基团相对于其他荧光素要更容易,并且反应过程中不需要加入活化试剂。

    荧光标记FITC修饰的多肽通常主要有两种形式:


    (a)在整条肽链N端接入FITC,并且在FITC之前接入一分子的Acp(6-氨基己酸),也称烷基间隔器。反应中FITC与肽链上裸露的-NH2反应,Acp的接入提供了六个碳的直链空间,大大降低了反应的空间位阻,提高了反应效率,降低了反应难度。其次,FITC还与多肽结构中的-SH,侧链-NH2反应,Acp的加入也降低了这种副反应发生的可能。此外,多肽在酸性环境条件下切割时,在N端接入FITC的多肽需要经历环化作用来形成荧光素,这种过程通常都会伴随最后一个氨基酸的切除,而烷基间隔器Acp的接入就避免了这一情况的发生。

    (b)在整条肽中的某个Lys侧链接入FITC,Lys侧链为末端为-NH2的四碳直链烷基,直接起到了降低空间位阻的作用。这种修饰方式能够灵活的在整条肽中任何位置进行FITC修饰,而不仅仅局限于末端。


    4.2荧光标记AMC修饰


    7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)是一种应用广泛的荧光标记试剂,例如,酶的痕量测定,酶的鉴定,激光染料的制备等多种用途,此外,C端用香豆素修饰的泛素分子也是研究蛋白质泛素化过程的重要探针。
    与其他荧光染料不同的是,AMC修饰多肽分子是从C端进行:
    AMC与肽链C端第一个氨基酸反应;
    固相合成整条肽链(从第二个氨基酸开始),并且保留整条肽链的侧链保护基和最后一个氨基保护基;
    液相缩合AA-AMC与全保护的肽链;
    切除保护基,完成肽链的修饰。



    4.3 荧光标记5-FAM修饰


    通常用于激光共聚焦显微镜和流式细胞技术的运用。



    4.4 荧光标记Rhodamine B(罗丹明 B)修饰


    罗丹明B是众多罗丹明染料中的一种,用于荧光测定。

    4.5 荧光标记5-TAMRA 修饰


    5-TAMRA是用于标记肽和蛋白质的最流行的橙色荧光团之一


    1、综述:


    Cy (Cyanine)系列,也叫菁染料,即花青素系列荧光染料是具有多聚次甲基桥链化学结构特点的一类合成荧光染料。Cy染料的次甲基桥链(1-7个次甲基)两端常常连着两个氮原子,其中一个氮原子带正电,从而Cy染料形成具有离域正电荷效应的介离子化合物。因为这个结构特点,Cy染料的消光系数(extinction coefficient)非常高。桥链长度和两端的发色团直接控制着染料的吸收峰和发射峰值,从而让Cy系列染料可以覆盖从紫外到远红外的几乎所有常用荧光谱带。桥链长度和两端的发色团直接控制着染料的吸收峰和发射峰值,从而让Cy系列染料可以覆盖从紫外到远红外的几乎所有常用荧光谱带。菁染料Cy系列常分为脂溶性Cy染料、水溶性Cy染料。


    青色素这一类荧光染料相对较少。它从青色素衍生而来,也是其名称的由来:Cy2、Cy3、Cy5 和Cy7。上述所有青色素均可以通过其反应基团与核酸,多肽和蛋白相连。其中,Cy3 and Cy5 是高消光系数的染料。特别适用于细胞内敏感的多肽定位实验,也是常用的多肽标记染料之一。关于青色素这类荧光,Cy5还因为对其周边电子环境特别敏感,该特征可用于酶测定。附着蛋白质的构象改变会导致荧光发射产生阳性或阴性变化。此外,Cy3和Cy5还可用于FRET试验。


    由于细胞和组织的自发荧光在近红外波段最小,因此在检测复杂生物系统时,近红外染料能提供更高的特异性和灵敏度。同时,由于光波在近红外区段的组织透过性更好。菁染料的摩尔吸光系数在荧光染料中是最高的,Cy7 NHS ester, Cy5.5 amine 和Cy3 azide 的吸收在近红外区背景非常低,是荧光强度最高、最稳定的长波长染料。特别适合于活体小动物体内成像代替放射性元素。


    2、脂溶性Cy染料

    脂溶性Cy染料包括Cy3,Cy3.5,Cy5,Cy5.5,Cy7和Cy7.5,其中Cy3,Cy5和Cy7的发色团是indolenine,而Cy3.5,Cy5.5和Cy7.5的是Benzoindole。Benzoindole仅仅比indolenine多了个苯环,这多余的一个苯环让整个染料吸收峰和发射峰红移,从而让Cy染料系列覆盖广泛的荧光谱图。Cy染料的结构几乎是对称的,为了让染料可标记,这其中的一个发色团上引伸出一个6碳链羧基来活化标记。
    虽带一个正电荷,脂溶性Cy染料的水溶性也比较低。在标记生物分子时(一般在缓冲溶液中),常常需要加入有机溶液(一般5-20%的DMF或者DMSO)助溶。常规是将染料先溶于有机溶剂中,然后按比例加入到生物分子的水溶液中反应,反应完成后离心除去沉淀的染料。当然脂溶性Cy染料也可以直接在有机溶剂中直接与有机小分子反应,标记小分子或者高分子材料。脂溶性Cy染料也易溶于氯仿,甲醇,THF,乙腈等常规有机溶剂。


    3、水溶性Cy染料:


    水溶性Cy染料是在脂溶性Cy染料的发色团上加入磺酸基团从而大大增加了染料的水溶性,同时还稍微提高了染料的光学稳定性和量子产率,因此水溶性染料更耐受光照,发出的荧光也稍强一些。
    由于磺酸盐的原因,这类染料的水溶性非常高,在标记反应中不需要加入任何有机溶剂助溶,另外标记上去的染料分子由于水溶性好不会聚集,也不会影响被标记大分子的稳定。这点非常重要,特别是当每个目标生物大分子上需要标记多个染料分子,或者目标生物大分子溶解度低,稳定性差时。

    4、Cy3 (Cyanine 3) 

    是一种发橘黄色荧光的花青素荧光染料。Cy3染料的激发峰和发射峰分别在550 nm和570 nm左右,它的荧光肉眼观察很明亮,并且对pH不敏感,在共聚焦显微镜中可以用532nm(肩峰)或者556nm(顶峰)的激光束激发,在普通荧光显微镜中可以用 TRITC (tetramethylrhodamine) 的滤片观察,所以在大部分荧光仪器上都可以使用。


    5、Cy7 (Sulfo-Cyanine7) 

    Cy7是一种荧光标记试剂 (Ex=750 nm,Em=773 nm)。Cy7 (Cyanine 7) 是一种近红外花青素荧光染料,磺化Cy7(Sulfo-Cy7)是它的水溶型,常常统称为Cy7。由于它的荧光波长(em:~770 nm)恰好处于肌体近红外窗口 I 的区域(肌体的血液,体液和在此区域背景荧光弱,并且长波长光子的穿透性较强),所以Cy7常常应用于小动物活体体内成像中。Cy7荧光肉眼不可见,所以在显微镜头下观察时需要借助CCD相机在成像软件中显示。另外近红外滤片较少见,很多荧光显微镜(包括共聚焦显微镜)并不配备,但是流式细胞仪(flow cytometry)常常配备有Cy7滤片组,IVIS等小动物成像系统、Odyssey近红外荧光扫描仪等设备也配备有。Cy7是常用荧光染料,Cy7可以用来标记核酸,蛋白,抗体,多肽,纳米粒等,它是常见的小动物显影剂之一。

    Cy7荧光基(fluorophore)是长链多次甲基结构。目前也有一些结构优化的Cy7染料,比如利用环己烯固化多次甲基桥链(polymethine),据称可荧光量子产率20%,但是这一结论目前还存在争论(Dyes and Pigments, 2013, 99, 275-283),可能并没有荧光增果。无论是哪种结构,Cy7及它的衍生物Cy7.5的量子产率都较低,一般都<0.1左右。量子产率偏低是近红外染料(包括近红外荧光蛋白)的通病,并且染料波长越长,量子产率越低,比如很多近红外窗口II染料的量子产率都低于0.01。

    普通Cy7的水溶性较低,所以在水相的标记反应体系内需要使用有机共溶剂,常用有机溶剂包括DMF,DMSO和乙腈等。如需标记的分子对有机溶剂敏感,可选择磺化Cy7。两者的光谱性质几乎一致,因此大部分应用可相互替换。磺化Cy7水溶性好,可在水相标记反应体系中直接使用,不需要有机溶剂助溶,适合标记对有机溶剂敏感的生物分子。另外由于强水溶性加染料分子本身带电荷,磺化Cy7标记到生物分子表面后不会引发疏水性聚集,荧光标记产物的稳定性。

    6、特点

    CY花菁染料的优点:


    1:菁染料的摩尔吸光系数在荧光染料中是最高的
    2:细胞和组织的自发荧光在近红外波段最小
    3:更高的特异性和灵敏度
    4:光波在近红外区段的组织透过性更好
    5:染料细胞毒性小 可用于标记抗体 蛋白 细胞。因此CY花菁染料是非常适合做小鼠活体成像的荧光染料


    CY花菁染料的缺点:


    1:菁染料的荧光量子效率相比其他染料较低,一般是0.1-0.2
    2:多川结构的菁染料容易发生聚集


    人们利用利用荧光标记的多肽来检测目标蛋白的活性,并将 其发展的高通量活性筛选方法应用于疾病治疗靶点蛋白的药物筛选和药物开发(例如,各种激 酶、磷酸酶、肽酶等)。


    合肥肽库生物科技能够提供技术成熟的各种荧光标记多肽。


    红色加粗的荧光基团,为常用基团


    Alexa Fluor系列


    标记基团
    入射波长
    发射波长
    标记位置
    Alexa Fluor 350
    346 
    445
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Alexa Fluor 405
    400
    424
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Alexa Fluor 430
    430
    545
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Alexa Fluor 488
    494
    517
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Alexa Fluor 514
    517
    542
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Alexa Fluor 532
    530
    555
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Alexa Fluor 594
    590
    617 肽链 N 端、Lys 侧链

    Bodipy系列


    标记基团
    入射波长
    发射波长
    标记位置
    Bodipy FL
    503
    509
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Bodipy R6G
    528
    550
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Bodipy 530/550
    534
    554
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Bodipy TMR-X
    542
    574
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Bodipy 558/568
    558
    569
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Bodipy 576/589
    576
    590
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Bodipy 581/591
    584
    592
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Bodipy 493/503
    500
    506
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Bodipy TR
    589
    617
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Bodipy 630/650
    625
    640
    肽链 N 端、Lys 侧链

    Cy系列


    标记基团
    入射波长
    发射波长
    标记位置
    Cy-3
    550
    570
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Cy-5
    646
    662
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Cy-5.5
    673
    707
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Cy-7
    750
    773
    肽链 N 端、Lys 侧链

    Fluorescein系列


    标记基团
    入射波长
    发射波长
    标记位置
    FITC
    492
    518
    肽链 N 端、Lys 侧链
    FAM
    494
    522
    肽链 N 端、Lys 侧链

    QSY系列


    标记基团
    入射波长
    发射波长
    标记位置
    QSY-7
    560
    None
    肽链 N 端、Lys 侧链
    QSY-9
    562
    None
    肽链 N 端、Lys 侧链
    QSY-21
    661
    None
    肽链 N 端、Lys 侧链


    Rhodamine系列


    标记基团
    入射波长
    发射波长
    标记位置
    Texas Red
    595
    615
    肽链 N 端、Lys 侧链
    RF488
    498
    520
    肽链 N 端、Lys 侧链
    TAMRA
    565
    580
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Rhodamine B
    555
    580
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Rhodamine Red-X
    570
    590
    肽链 N 端、Lys 侧链

    其它荧光标记


    标记基团
    入射波长
    发射波长
    标记位置
    Dansyl
    333
    518
    肽链 N 端、Lys 侧链
    Dabcyl
    454
    None
    肽链 N 端、Lys 侧链
    DNP
    350
    None
    肽链 N 端、Lys 侧链
    MCA
    358
    410
    肽链 N 端、Lys 侧链
    SBF
    385
    None
    cys 侧链
    EDANS
    335
    493
    Glu或Asp侧链
    7-OHCCA
    342(pH=4)
    447(pH=4) 肽链 N 端、Lys 侧链
    Dacia
    376
    465
    cys侧链
    BHQ-1
    480
    580
    肽链 N 端、Lys 侧链
    BHQ-2
    560
    670
    肽链 N 端、Lys 侧链
    BHQ-3
    620
    730
    肽链 N 端、Lys 侧链
    JOE
    520
    548
    肽链 N 端、Lys 侧链

    常用的荧光基团及淬灭基团组合


    组合 荧光 对应组合荧光
    1 DABCYL
    EDANS
    2 DABCYL
    6-FAM
    3 TAMRA
    6-FAM
    4 Abz
    Tyr(3-NO2)
    5 Mca
    Dnp

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