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肽核酸合成

    一、PNA简介


        PNA(peptide nucleic acids, PNA)肽核酸技术,是90年代丹麦科学家发明的一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物,即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架,其余的与DNA相同,PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列,形成稳定的双螺旋结构。由于PNA没有带电荷的磷酸基团,因此不存在静电排斥。这使得PNA跟DNA结合比DNA与DNA之间的结合更加牢固。PNA既不是多肽,也不是核酸,因此DNA酶跟蛋白酶都不能水解PNA,无论在体外或者体内,PNA都相当稳定。

    1、跟DNA、RNA相比,PNA 有2个最重要的特点是:

    1)跟对应的核酸结合,Tm 值高,稳定性强。

    2)跟对应核酸序列结合,特异性非常高:完全配对时,Tm值比对应的DNA-DNA高;如果有一个碱基不配对,Tm 值会下降15℃左右,比对应的DNA-DNA Tm 值低;如果有2个碱基不配对,完全不能结合。 基于以上不同于DNA、RNA 的特性,PNA 为生命科学的研究及药物开发提供了新的思路。

    2、PNA特性&优势

    强结合力:PNA是由电中性的酰胺骨架组成,因此PNA链与DNA链之间无排斥现象,因此,PNA与DNA之间具有更强的结合力。

    强特异性及灵敏性:在不存在错配的情况下,PNA/DNA结合稳定性强于DNA/DNA;在错配情况下,PNA/DNA结合稳定性弱于DNA/DNA。即便是单个碱基错配,也会造成溶解曲线的巨大差异。因此,可以区分单个碱基的错配。没出现1个碱基的错配,Tm值平均降低15°C,如果2个碱基错配,则完全不能杂交,因此特异性极高。

    强稳定性:PNA具有较强的化学,生物学,热力学稳定性。PNA在高温,强PH条件下,均具有较强的稳定性。并且由于PNA骨架有别于核酸以及多肽骨架,因此,核酸酶及蛋白酶均不易降解PNA。

    强杂交稳定性:PNA在高盐浓度的杂交液中具有较强的稳定性,以及结合力。因此,PNA可以作为比较稳定的杂交探针应用于科学研究。在相同条件下,15个相同序列的碱基,DNA/DNA的Tm值为53.3°C,DNA/RNA的Tm值为50.6°C,PNA/DNA的Tm值高达69.5°C,PNA/PNA更是高达72.3°C,即与相同序列的天然核酸碱基序列相比,每增加1个碱基,解链温度提高1°C,大大提高了杂交稳定性。

    强安全性:PNA几乎没有毒性,为小鼠经脉注射PNA,2h后观察PNA存在于所有的组织器官中,而90%的PNA在用药后24 h内以未经修饰的形式经尿排出,因此PNA对于生物体来说,具有很高的安全性。


    二、PNA 设计及注意事项


    1. 结合特性。虽然从理论上讲,PNA可以从两个方向来和目的片段形成杂交体,但实际上,最常见的是反向结合( anti-parallel orientation)。PNA的N末端相当于寡核苷酸的5′端,因此也经常被称为PNA的5′端。和普通的DNA/DNA杂交体相比较,PNA/DNA具有较高的Tm值。一般而言,在100mM NaCl的条件下,每个碱基对的Tm值会升高大约1°C。

    2. 长度。由于PNA具有很高的亲和力(higheraffinity),因此不需要设计很长的序列,一般而言12-18个已经足以满足需要,这和其他常规25-40个寡核苷酸探针有着巨大的区别。我们必须要记得,序列越短,则其特异性就越高。对PNA而言,有时更短的序列也会达到预期的效果。反而长的PNA会发生聚集沉淀(aggregate),而影响下游的纯化和分析。

    3. 嘌呤含量。嘌呤含量高的PNA,特别是鸟嘌呤G,也容易发生聚集沉淀(aggregate)。所以,在任何10个连续的PNA单体中,不要有6个或者更多的嘌呤出现。因此,从这意义上讲,越短的PNA序列,那么就越不需要担心设计上出现问题。

    4. 自身互补。尽量来防止自身互补(Self-complementarity)的发生。在序列设计上,避免反向重复(inverserepeats),发夹结构(hairpinforming),和回文序列(palindromic sequences)。

    5. 改善溶解性。当 PNA 链较长(>22mer)或者嘌呤含量高(>60%) 时,为了提高 PNA 探针的溶解性,我们建议在序列中加入一些助溶基团如 O linker、E linker、X linker 或者两个赖氨酸。当 PNA 偶联多肽或染料时,接头(linker) 可以起到空间间隔(spacer)的作用。

    6. 标记 PNA。 PNA 链 5′ 端和 3′ 端均可以标记。由于 3′ 端是非活性基团(-CONH2),所以需加入一个赖氨酸,其侧链上的氨基可以用来标记。如果在 5′ 端标记,我们建议在 PNA 和标记物之间加 1~2 O linkers。标记物:荧光基团(—NHS 酯或羧基酰胺)、生物素等。

    三、PNA 的订购


    PNA的价格取决于序列长度、产量和修饰标记,请联系我们的销售人员。

    最低订购量: 未标记 PNA 50 nmole,标记PNA 25 nmole。

    提供PNA的纯度大于>95%,HPLC 纯度分析报告、质谱分析报告,一般3~4周交货。

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