免疫检查点抑制剂（ICIs）已彻底改变了癌症治疗，但其疗效在患者之间存在显著差异。这种差异可能与肿瘤微环境中免疫浸润的程度有关。免疫监视，特别是对肿瘤浸润性白细胞（如CD4+ T细胞）的监测，有助于预测ICI的疗效。本研究报道了两种靶向CD4的肽类PET示踪剂的发现及其临床前特征分析。

方法：  肽的发现基于噬菌体展示技术的生物淘选，筛选出的肽由商业公司合成（纯度>95%）。所有肽与人CD4（hCD4）的结合特性通过Biacore X100表面等离子共振（SPR）进行表征。对能够结合hCD4的肽还评估了其与阴性对照蛋白以及小鼠CD4（mCD4）的结合情况。所有SPR实验均通过参考和空白扣除进行分析，并拟合至1:1 Langmuir模型。肽与hCD4相互作用的能力采用MxPro3005 qPCR仪器上的Sypro Orange热熔解实验（TSA）进行评估，并通过Boltzmann拟合确定中点温度（Tm）。肽11（P11）和肽17（P17）经DOTA偶联（纯度>95%），并用铜-64（64Cu）标记（放射化学纯度>95%），用于在西门子Inveon PET/CT扫描仪上对C57BL/6J hCD4基因敲入（KI）模型及对照（野生型）模型进行体内PET/CT成像。小鼠在注射后1小时和3小时进行成像，所选器官的PET信号经衰减校正后，以每克组织注入剂量百分比（%ID/g）进行定量分析。由于脾脏中CD4+ T细胞的数量相对较高，因此成为关注的器官。

结果：  合成了20个肽段并进行了SPR检测。P11和P17在SPR上表现出对hCD4的选择性结合，其亲和力分别为KD=0.96 µM和2.39 µM。P11引起了显著的Tm值变化（57.3±0.28°C，p<0.0001），且[64Cu]Cu-DOTA-P11 PET/CT成像显示，在两种模型中，注射后1小时和3小时脾脏摄取均较高。P11与mCD4的结合亲和力估计为KD=26.6 nM。[64Cu]Cu-DOTA-P17 PET/CT成像显示，在hCD4 KI模型中，注射后1小时脾脏摄取显著升高（0.71±0.10 %ID/g，p<0.05），但在后续时间点未见明显差异。

结论：  P11 以纳摩尔亲和力结合 hCD4，且显著的熔解温度（Tm）升高表明 hCD4 与 P11 之间存在相互作用。使用 [64Cu]Cu-DOTA-P11 进行 PET/CT 成像显示，在两种模型中脾脏均表现出较高的摄取。这一结果以及 P11 对 mCD4 的纳摩尔级亲和力提示其具有交叉反应性。未来研究需在不依赖 hCD4 与 mCD4 差异的其他动物模型中评估 [64Cu]Cu-DOTA-P11，例如采用高表达和低表达 hCD4 的异种移植侧腹肿瘤模型。P17 以低微摩尔亲和力结合 hCD4。使用 [64Cu]Cu-DOTA-P17 进行 PET/CT 成像显示，1 小时后在 hCD4 基因敲入小鼠的脾脏中摄取显著更高。