今天分享，由 '山东省肿瘤医院及研究所放射肿瘤科、山东第一医科大学及山东省医学科学院'发表在《Drug Resistance Updates》的  《Peptide-based PET/CT imaging visualizes PD-L1-driven radioresistance in glioblastoma》

放射抵抗仍是胶质母细胞瘤（GBM）放疗治疗中的重大挑战。PD-L1表达是 GBM 患者出现放射抵抗和免疫逃逸的关键因素。目前缺乏有效方法监测患者放疗期间PD-L1水平的变化，导致难以及时干预并管理这种抵抗现象。

本研究开发了一种新型肽类示踪剂[¹⁸F]AlF-NOTA-PCP₂用于PET/CT成像，可直观显示放疗后PD-L1表达的变化，揭示了 GBM 中由PD-L1介导的放射抵抗机制。该示踪剂在体外实验中表现出对PD-L1的高度特异性结合能力；在 GBM 异种移植瘤模型中，PET/CT检测到的[¹⁸F]AlF-NOTA-PCP₂摄取量与免疫组化（IHC）检测的PD-L1表达水平呈显著正相关（R² =0.861，P<0.001）。PD-L1阳性肿瘤中放射性示踪剂的摄取量在放疗后显著升高（21.25% ± 0.91 % vs. 25.12 ± 0.82%，P=0.008），这与这些肿瘤中观察到的放射抵抗现象一致。体外研究表明，PD-L1通过激活PI3K-Akt通路上调RAD51蛋白，从而增强DNA损伤修复能力，进而引发放射抵抗。针对一名接受放疗的 GBM 患者的初步临床应用证实了该示踪剂监测PD-L1动态变化的能力，为其临床转化提供了有力支持。总体而言，这种基于肽类的小分子PET/CT放射性示踪剂提供了一种无创、实时且定量的方法，可动态显示 GBM 中由PD-L1介导的放射抗性。该示踪剂有望成为理想的放射性标记物，用于辅助患者分层、调整治疗方案以及指导个体化免疫治疗策略。

一种由15个氨基酸组成、分子量为2444.75 Da的新型探针NOTA-PCP2表现出亲水性特征，其logP（油/水）值为−6.15（图1A）。该NOTA螯合剂被用于Al18F放射性氟标记反应，在25分钟内成功合成出[18F]AlF-NOTA-PCP2，产率达41.5±4.3%（n=20），纯度超过95%（图1B、C）。该示踪剂在体外表现出优异稳定性：在含0.9%氯化钠和5% HSA 的溶液中可保持超过95%的放射化学纯度长达4小时（图1D）。其摩尔活度范围为37–55 GBq/ μmol ，宏观呈无色透明状，pH值为6.5–7.0。

分子对接结果表明，NOTA-PCP2与PD-L1的结合位点存在空间互补性（图1E）。NOTA-PCP2与PD-L1的对接评分为−12.96 kcal/mol。NOTA-PCP2与PD-L1之间形成的氢键涉及Gly119、Glu58、Ala121和His69残基，共同贡献了结合能（图1F）。表面等离子体共振（SPR）分析显示，NOTA-PCP2与人源PD-L1的解离常数（KD）为2.402 ± 0.799 × 10⁻¹⁰ mol/L，与NOTA-PCP1的数值（3.425 ± 0.913 ×10− 10⁻¹⁰ mol/L）相当（P = 0.1067）（图1G）。

为验证[18F]AlF-NOTA-PCP2对PD-L1的靶向特异性，在体外实验中，作者对具有不同PD-L1表达水平的U251MG和A172细胞系进行了细胞结合实验。U251MG细胞的示踪剂摄取量比A172细胞高3.26倍（P < 0.001）。使用1 μmol/L NOTA-PCP2进行阻断后，60分钟时U251MG细胞的摄取量降至0.1%（图1H）。蛋白质印迹和流式细胞术分析证实，U251MG细胞的总PD-L1及表面PD-L1表达水平均高于A172细胞（图2I、J）。此外，我们在基因工程改造的U87MG细胞系中验证了[18F]AlF-NOTA-PCP2的特异性：U87MGPD-L1OE细胞的摄取量显著更高（2.075 ± 0.178 %) compared to U87MG (0.393 ± 0.055 %) and U87MGPD-L1 KO (0.107 ± 0.008%）；经1 μmol/L NOTA-PCP2阻断后，U87MGPD-L1OE细胞的摄取量降低超过90%，进一步证实了该示踪剂的特异性（图1K）。蛋白质印迹和流式细胞术均验证了这些细胞系中存在PD-L1表达（图1L、M）。这些结果表明[18F]AlF-NOTA-PCP2对PD-L1具有高度特异性，适用于精准检测肿瘤模型中的PD-L1表达水平。

为评估[¹⁸F]AlF-NOTA-PCP2的生物安全性，作者进行了全面评估，包括血液学检查、血清生化检测、组织病理学分析以及对小鼠生理和行为变化的监测。检测了反映心脏、肾脏和肝脏功能的关键生物标志物，包括肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）、血尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）。在注射后12、24和48小时，[¹⁸F]AlF-NOTA-PCP2组与对照组在这些生物标志物、体重或整体外观方面均未观察到显著差异（图3A）。常规血液检测及包括主要器官苏木精-伊红（H&E）染色在内的组织病理学分析均未显示形态学异常或器官损伤、炎症或坏死迹象（图3B）。这些结果表明，[¹⁸F]AlF-NOTA-PCP2不会对器官功能或组织完整性产生急性毒性作用。

3.[18F]AlF-NOTA-PCP2在表达PD-L1的肿瘤中的药代动力学与生物分布：一项比较性PET成像研究

为研究[¹⁸F]AlFNOTA-PCP2的药代动力学及生物分布特性，作者采用携带人源U118MG肿瘤异种移植瘤的NOD/ SCID 小鼠模型，鉴于[¹⁸F]AlF-NOTA-PCP2表现出物种特异性的PD-L1结合能力。具体而言，[¹⁸F]AlF-NOTA-PCP2对人源PD-L1具有高亲和力（KD = 2.401 × 10⁻ ¹⁰ mol/L，图2G），而对小鼠PD-L1的亲和力较弱（KD = 3.125 × 10⁻ ⁵ mol/L；图S2A）。体外与体内实验均证实其与小鼠PD-L1的结合能力有限（图S2B-D），因此需使用人源肿瘤模型进行精确评估。 GBM 异种移植瘤小鼠的微PET成像显示，注射后最早15分钟即可检测到肿瘤内放射性示踪剂的积聚；随时间推移至240分钟时仍可观察到显著信号（图3C）。肾脏和膀胱中均出现高浓度放射性示踪剂，这反映了其亲水性特征及快速的肾脏排泄特性。最佳肿瘤对比度出现在60至120分钟之间。注射后60分钟的进一步评估显示，SF126肿瘤中示踪剂摄取量为中等水平（3.52±0.51%），而PD-L1阴性A172肿瘤中的摄取量较低（1.51±0.24%）。使用2 mg/kg非放射性PCP2进行预处理可显著降低SF126异种移植瘤中的示踪剂摄取，这进一步证实了[18F]AlF-NOTA-PCP2对PD-L1的特异性（图3D）。通过流式细胞术对三种 GBM 细胞系的PD-L1表达水平进行了定量分析，结果与影像学观察结果一致（图3E）。

为验证这些成像结果并评估[¹⁸F]AlF-NOTA-PCP₂在正常组织中的生物分布情况，作者在注射后15、30、60、90、120、180及240分钟进行了离体测量（图3F）。对携带U118MG肿瘤小鼠肌肉与血液样本的肿瘤/器官比值分析表明，注射后60至180分钟期间背景比值最为理想（图3G），因此后续实验均选择该时间点。

通过[¹⁸F]AlF-NOTA-PCP₂与我们此前基于环肽WL12开发的放射性示踪剂[¹⁸F]AlF-NOTA-PCP₁的PET/CT对比成像显示，[¹⁸F]AlF-NOTA-PCP₂的肿瘤摄取率略低于后者（11.16 ± 0.948 % vs. 12.74 ± 0.971%，P=0.036）（图3H）；但其非特异性肝脏摄取率显著更低（0.823 ± 0.249 % vs. 21.38 ± 0.859%）。进一步离体生物分布研究表明，[¹⁸F]AlF-NOTA-PCP₂在肺部的分布量也显著较低（0.61 ± 0.13 % vs. 7.58 ± 1.9 %)，spleen (0.38 ± 0.16 % vs. 6.92 ± 0.98 %)，and intestine (0.56 ± 0.12 % vs. 7.26 ± 1.1%，P<0.001）（图3I）。注射后60分钟时的各项肿瘤/血液、肿瘤/肌肉及肿瘤/肝脏比值均表明[¹⁸F]AlF-NOTA-PCP₂的表现显著优于[¹⁸F]AlF-NOTA-PCP₁（图3J）。

为验证[18F]AlF-NOTA-PCP2在 GBM 模型中对PD-L1的特异性，作者采用非肥胖型糖尿病/严重联合免疫缺陷（NOD- SCID）小鼠模型，分别植入高表达PD-L1的U251MG或低表达PD-L1的A172 GBM 异种移植瘤。微PET/CT成像显示U251MG肿瘤中放射性积聚显著（9.43±0.42% ID/cc），而A172肿瘤中积聚极少（1.73±0.17% ID/cc）。组织学分析证实了这些PET/CT结果（图4A）。进一步研究使用了具有不同PD-L1表达水平的基因工程细胞系来源肿瘤：U87MGPD-L1OE、U87MG和U87MGPD-L1KO。这些模型的放射性示踪剂摄取量呈递减趋势，其中U87MGPD-L1OE肿瘤摄取最高（24.67±1.25% ID/cc），U87MGPD-L1KO肿瘤最低（1.07±0.71% ID/cc）。 IHC 检测结果也印证了这一结论，其显示PD-L1表达强度依次从强到弱（图4B）。

为评估其临床相关性，作者采用立体定向技术将U87MG细胞植入NOD- SCID 小鼠脑内，建立原位脑肿瘤模型。为进一步验证示踪剂的特异性，我们使用了具有不同PD-L1表达水平的基因工程U87MG细胞系：U87MGPDL1OE、U87MG和U87MGPD-L1KO。微PET/CT成像及相应 IHC 结果均显示与PD-L1表达水平相符的独特示踪剂摄取模式（图4C）。值得注意的是，原位肿瘤的摄取率略低于皮下移植模型（9.366 ± 0.212 % vs. 9.993 ± 0.284%，P = 0.019），但60分钟时肿瘤与正常脑组织的对比度比值显著升高至117.1 ± 1.44，充分体现了[18F]AlF-NOTA-PCP2优异的诊断性能——远超肿瘤与肌肉组织的比值（23.5 ± 1.55) and tumor-to-blood (33 ± 1.33）。脑组织切片的 IHC 染色结果证实了PD-L1的表达：U87MG肿瘤组织中的PD-L1染色强度明显高于正常脑区（图4C）。对肿瘤区域的定量分析表明，[18F]AlF-NOTA-PCP2的摄取量与PD-L1肿瘤比例评分（TPS）存在强空间相关性，证明该示踪剂能精准反映 GBM 模型中的PD-L1表达情况（R² = 0.83；P < 0.0001；图4D、E）。

为探究[¹⁸F]AlF-NOTA-PCP2在追踪放射治疗诱导的 GBM 模型中PD-L1表达上调的能力，作者在小鼠体内建立了双侧皮下异种移植肿瘤模型，并于放疗前进行MicroPET/CT扫描。右侧肿瘤接受分次放疗（每次3 Gy，每日一次，连续5天，总剂量15 Gy），左侧肿瘤则接受单次10 Gy照射。治疗后影像显示两种治疗组的示踪剂摄取均增加，其中分次放疗组的摄取量显著更高（图5A）。Micro-PET/CT扫描进一步表明，与接受单次等效剂量照射的区域相比，分次放疗区域的示踪剂摄取量显著升高。扫描完成后切除肿瘤组织进行PD-L1 IHC 分析，结果显示肿瘤组织中PD-L1表达增加，与Micro-PET/CT结果一致（图5B）。定量分析显示分次放疗组的示踪剂摄取率为12.6±0.374%，高于单次照射组的10.53±0.694%（P=0.021），且均显著高于未治疗对照组的8.867±0.449%（P<0.05）（图5C）。

为评估放射治疗剂量对PD-L1表达的影响，研究人员分别使用不同辐射剂量（0、2、5、10、15 Gy）处理U87MG和U251MG细胞系。流式细胞术分析显示表面PD-L1表达呈剂量依赖性增加，且U87MG与U251MG细胞系之间存在差异（图5D、E）。免疫印迹实验进一步证实总PD-L1表达量随辐射剂量增加而升高，表明PD-L1在放射治疗反应中起重要作用（图5F、G）。

综上所述，[18F]AlF-NOTA-PCP2 PET/CT能够监测 GBM 模型中放疗诱导的PD-L1表达上调，这表明该放射性示踪剂可用于动态反映PD-L1状态，并凸显其根据生物反应优化放疗方案的潜力。

大多数研究均聚焦于PD-L1通过抑制T细胞在免疫逃逸中的作用。然而，其独立于免疫调节的生物学功能——尤其是涉及影响放射治疗疗效的细胞内信号通路的功能——目前尚不明确。因此，本研究重点探讨不依赖于免疫调节的放射抵抗机制，尤其旨在验证放射治疗与PD-L1之间的关联。PD-L1的表达水平及其效应，促使作者采用免疫缺陷裸鼠模型来直接评估这些效应而避免免疫干扰。我们提出假设：PD-L1的表达状态与放射抗性相关，且可通过该模型进行可视化和定量分析，通过[¹⁸F]AlF-NOTA-PCP2 PET/CT成像技术。为验证这一假说，我们建立了具有不同PD-L1表达水平的皮下异种移植肿瘤模型：U87MGPD-L1OE、U87MG及U87MGPD-L1KO。这些肿瘤均接受放射治疗（8 Gy×3次），并观察其肿瘤体积变化。我们对相关数据进行了记录，并在治疗过程中通过[¹⁸F]AlF-NOTA-PCP₂ PET/CT动态监测了PD-L1水平的变化（图6A）。结果显示，PD-L1基因敲除显著增强了U87MG肿瘤的放射敏感性，而其过表达则促进了肿瘤的放射抵抗性（P<0.05）（图6B、C）。肿瘤影像照片（图6D）及肿瘤重量数据（图6E）均支持PD-L1水平升高会增强NOD- SCID 小鼠肿瘤对放疗的抵抗作用。微PET/CT数据显示：放疗前PD-L1阴性（U87MGPD-L1KO）肿瘤中放射性示踪剂积聚量较低，且放疗后未出现显著增加，这与肿瘤生长速度减缓相关；对肿瘤感兴趣区域（ROI）的定量分析进一步验证了微PET/CT成像结果。相比之下，PD-L1阳性（U87MGPD-L1OE）肿瘤中的放射性示踪剂摄取呈现先上升后逐渐下降的动态变化模式（P<0.05），表明该类肿瘤对放疗具有显著抵抗性；肿瘤ROI定量摄取分析结果也证实了上述影像学发现（图6F）。为深入验证这些结论，作者建立了使用U87MGPD-L1OE和U87MGPD-L1KO细胞系的原位胶质母细胞瘤模型（图6G）。与皮下肿瘤一致，PD-L1阴性肿瘤表现出增强的放射敏感性（特征为放射性示踪剂摄取量低且放疗期间变化微小）；而PD-L1过表达肿瘤则呈现抗药性（表现为高放射性示踪剂摄取量且放疗后一周即出现显著变化，P=0.026，图6H）。这些结果进一步证实了[18F]AlF-NOTA-PCP2 PET/CT成像技术在 GBM 模型中显示PD-L1介导的放射抗性的应用价值。

为探究PD-L1在 GBM 放射治疗耐药性中除免疫检查点外的作用，作者进行了细胞凋亡、细胞周期及DNA损伤检测。图7A结果显示，未处理的U87MG细胞与U87MGPD-L1OE细胞的凋亡率无显著差异（P>0.05）；但照射24小时后（8 Gy×1次），U87MG细胞的凋亡率从11.03%降至U87MGPD-L1OE细胞的3.2%（P<0.01）。细胞周期分析表明，两组细胞的G2/M期比例无显著差异（P>0.05）：照射后24小时，U87MG细胞中60.4%处于G2/M期，而U87MGPD-L1OE细胞仅为45.8%（图7B）。这些结果提示U87MGPD-L1OE细胞在照射后更快地通过G2/M期，可能与更高的DNA修复效率或更低的DNA损伤水平有关。随后我们评估了PD-L1表达升高是否影响DNA修复能力：流式细胞术显示两组细胞的基础 γH2AX 表达水平无显著差异；而在接受8 Gy照射处理后，两种细胞类型的 γH2AX 表达均有所增加，但U87MGPD-L1OE细胞中的表达水平显著低于U87MG细胞（图7C）。这表明PD-L1可通过增强DNA损伤修复来介导辐射抗性，且该作用不依赖于免疫检查点机制。

为深入探究PD-L1如何影响放射治疗耐药性，作者对U87MGPD-L1OE、U87MG及U87MGPD-L1KO细胞经8 Gy照射后进行了RNA测序分析。结果显示：与U87MG照射组相比，U87MGPD-L1KO照射组中有2056个基因表达上调（变化倍数达1.5倍），1043个基因表达下调（图7D）；而U87MGPD-L1OE照射组则有867个基因表达上调，1901个基因表达下调（图7E）。进一步通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析发现，两组差异表达基因中排名前三的关键信号通路主要集中在癌症通路、PI3K-Akt信号通路以及细胞因子-细胞因子受体相互作用通路（图7F）。

为验证RNA-seq结果，作者向U87MG细胞中添加了100 ng/mL的PDL1-Fc，并在1小时和24小时分别分析了蛋白质提取物。在治疗后数小时检测细胞的即时及延迟反应。作者发现两个时间点的pAKT水平均显著升高，表明PD-L1-Fc可能激活了PI3K/ AKT 信号通路。为验证这一激活作用，作者使用了PI3K/ AKT 通路抑制剂LY294002，该药物能有效抑制U87MG和U251MG细胞中PD-L1依赖性的 AKT 磷酸化（图7G-J）。此外，对DNA双链断裂同源重组修复至关重要的RAD51蛋白（与放射治疗耐药性相关）在PD-L1-Fc处理24小时后显著上调，而1小时时未见明显变化；后续使用LY294002处理可降低24小时时的RAD51表达水平，提示PD-L1-Fc通过PI3K/ AKT 通路发挥部分调控作用（图7H-K）。这些结果表明：PD-L1水平升高可激活PI3K/ AKT 通路，从而部分增强RAD51表达并促进放射治疗耐药性。该机制不仅揭示了PD-L1介导的放射耐药性超越免疫逃逸的作用机制，更凸显了PI3K/ AKT /RAD51轴作为潜在治疗靶点的重要性。然而，仍需进一步研究以阐明RAD51表达的具体调控机制及其与PI3K/ AKT 通路的确切关联。

我们的上述研究结果表明，PD-L1水平升高的肿瘤更易对放射治疗产生耐药性。然而，目前尚不清楚放射治疗耐药细胞系是否持续保持稳定的PD-L1水平升高。为探究PD-L1与放射治疗耐药之间的因果关系，我们建立了放射治疗耐药细胞系（图8A）并检测了PD-L1的表达水平。结果显示：经8 Gy照射后，放射耐药型U87MG细胞（U87MG Resistant-RT）的凋亡率仅为4.36%，显著低于对照组U87MG细胞的9.67%（P < 0.05）（图8B）；流式细胞术分析亦表明，照射后U87MG Resistant-RT细胞的 γH2AX 水平明显低于对照组（图8C），这些结果证实了放射治疗耐药细胞系的成功构建。后续通过流式细胞术对这些细胞系中PD-L1表达的分析显示，其平均荧光强度无显著差异（P > 0.05）（图8D），表明PD-L1水平升高可导致放射治疗耐药，但耐药本身并不会引起PD-L1水平的持续升高。

8.[18F]AlF-NOTA-PCP2在 GBM 中的初步临床研究：生物分布与摄取（放疗前及放疗后）

本研究纳入了四名 GBM 患者组成的队列，包括三名男性和一名女性，中位年龄为66.5岁。基线评估证实所有患者的肝肾功能均正常。其中三名受试者在注射后30分钟、60分钟和90分钟接受了动态PET/CT扫描，以评估示踪剂的体内分布情况；一名患者在放射治疗前后均接受了扫描。该队列的详细临床特征见表1。[¹⁸F]AlF-NOTA-PCP₂的平均给药活度为234.03 ± 31.04 MBq（范围：187.2–274.2 MBq）。在注射期间及注射后24小时内，未观察到生命体征（体温、心率和血压）、血液实验室指标或心电图出现显著变化，这证实了[¹⁸F]AlF-NOTA-PCP₂示踪剂在此患者群体中的安全性和耐受性。

如图9A和B所示，[18F]AlF-NOTA-PCP2在脾脏中表现出最高的平均标准化摄取值（SUVmean）。（21.09 ± 2.63），在肝脏中呈现中度蓄积（5.85 ± 1.63)，pancreas (4.23 ± 1.19)，kidneys (3.19 ± 0.69)，and myocardium (3.03 ± 0.19）。该示踪剂在脑、肌肉、肺、腮腺、甲状腺及颌下腺等其他器官中的摄取量极低。在 GBM 肿瘤中，最大标准化摄取值（SUVmax）为0.853 ± 0.518。鉴于正常脑组织的摄取量可忽略不计，肿瘤与背景组织的比值高达34.4倍（表1）。值得注意的是，人体内的生物分布及器官摄取模式与小鼠模型中观察到的结果存在差异（图3F）。

其中一名参与者为一名64岁男性，经活检确诊患有PD-L1阳性胰岛 GBM（TPS：5%）（图9C），在放疗前后均接受了PET/CT检查，结果显示治疗后SUVmax（1.28 vs. 0.76）和SUVmean（0.63 vs. 0.41）均显著升高（图9D、E）。尽管后续MRI检查提示三个月后可能存在肿瘤进展，但缺乏放疗后的活检结果无法明确证实其放射抵抗性（图9F）。这些发现充分证明[18F]AlFNOTA-PCP2在无创监测PD-L1动态变化方面已成功实现初步临床应用，有必要开展进一步研究以验证其对治疗结局的预测价值。

参考文献：doi.org/10.1016/j.drup.2025.101202