骨架环肽（BMPs）是一类出现在多种天然生物活性产物中的极具吸引力的分子。然而，由于 mRNA 展示技术与核糖体合成相结合时会丢失与 mRNA 基因型相连的 C 端肽区，因此这种技术本质上不适用于此类肽表型。为了解决这个问题，文章设计了一种新策略，通过 S 到 N 的酰基转移来连接侧链与 S 主链的键，从而将 BMPs 与肽的 C 端片段连接起来。在此，文章报告了将此策略应用于构建与同源 mRNA 融合的 BMPs 库。该库被用于筛选针对 Akt2 的 BMP 配体，Akt2 参与了癌症发病的信号通路。结果，从该库中成功筛选出了针对 Akt2 的 BMP 配体。最有效的 Akt2 抑制剂 BMPakti-3 显示出 1.3 nM 的解离常数和 34 nM 的半数最大抑制浓度（IC50）。该系统为从头发现针对各种感兴趣蛋白质靶点的生物活性 BMP 配体提供了一个独特的平台。

本工作采用接头肽偶联策略：首先，利用定制的灵活体外翻译（FIT）系统，通过起始密码子重编程和密码子扩展，将起始及延伸AUG分别编码为ThzCys-Cab和^HSF^pCl（图2b），表达含N端ThzCys（噻唑烷保护半胱氨酸）、中间Cab（2-氯乙酰基-2,4-二氨基丁酸）与（^HSF^pCl）（3-(4-氯苯基)-2-巯基丙酸）的线性肽；其C端连接Ile-Gly-Cys-Gly-Asn-Ser接头肽，并通过嘌呤霉素接头共价锚定于mRNA 3′端（图2a、c）。翻译过程中，^HSF^pCl的硫酯自发与接头肽中Cys侧链硫醇发生硫酯交换，释放α-硫代酸硫醇；该硫醇随即亲核进攻Cab的氯乙酰基，形成稳定硫醚键，实现BMP前体与C端接头肽的侧链共价连接（图1b）。随后立即进行mRNA逆转录为cDNA，以避免pH或盐浓度变化导致的偶联效率下降（图1b）。

逆转录后，加入含NaBH₃CN的乙酸钠缓冲液（pH 4.8）脱除Thz保护基，生成N端甲基半胱氨酸（MeCys）（图1b）；随后用HEPES-NaOH缓冲液将pH升至8.0，触发天然化学连接（NCL）介导的自发骨架环化：MeCys硫醇亲核进攻下游Cys硫酯，经硫酯交换与硫→氮酰基转移，形成肽键，完成首尾大环闭合（图1b）。最后加入碘乙酰胺烷基化游离硫醇，抑制副反应（图1b）。由此获得的BMP文库通过硫醚键与接头肽共价连接至对应mRNA/cDNA，实现表型与基因型的物理关联。

筛选采用负向—正向两步法：先将BMP文库与裸磁珠孵育，去除非特异性结合组分；再与Akt2蛋白偶联磁珠结合，进行靶向富集（图3）。经五轮迭代筛选，获得三个候选BMP Akt2抑制剂（BMPakti-1、BMPakti-2、BMPakti-3），用于后续化学合成及亲和力、酶抑制活性和血清稳定性评估（表1）。

与Akt2的亲和力方面，文章通过表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）进行表征（表1），结果显示三种BMP与Akt2的KD值处于10-8至10-9 M数量级，其中 BMPakti-3的亲和力最强，KD值为1.3 nM。

采用ADP-Glo激酶检测法评估Akt2抑制活性，三者均具抑制作用，IC₅₀为10–100 nM；与已报道最优硫醚大环肽（TMP）抑制剂Pakti-L1（IC₅₀ = 110 nM）相比，BMPakti-1、BMPakti-2和BMPakti-3活性相当或更优（表1）。

三种BMP抑制剂均含RxRTxRIYzR基序（表1），与Akt2经典底物肽Crosstide（H₂N-GRPRTSSFAEG-OH）序列相似。其中，Crosstide的R5和R3残基结合Akt2的E236、E279和E342，T2残基则与E279羧基相互作用。表明三者很可能靶向Akt2同一底物结合位点。

鉴于硫醚键通常不直接参与特异性结合，作者探究了将BMP中一个或多个骨架残基替换为硫醚键是否可生成具活性的硫醚大环肽（TMP）抑制剂（图5）。基于BMPakti-1、BMPakti-2和BMPakti-3设计对应TMPs（TMPakti-1、TMPakti-2、TMPakti-3；表1），其KD与IC₅₀测定显示：三者均具结合与抑制活性，但显著弱于母体BMP（表1，图4）。作者推测，TMP环化位点引入可旋转单键，降低了构象预组织程度，增大结合熵罚。血清稳定性测试表明：尽管BMP含较多精氨酸，其半衰期仍达5–11 h；TMP半衰期为7–23 h（表1）。结果证实，大环结构本身即可支撑高结合力与血清稳定性，连接方式并非决定性因素。

在本研究中，文章首次报道了骨架大环肽（BMPs）的快速亲和力驱动筛选（RaPID）选择，并成功鉴定出针对 Akt2 的高亲和力抑制剂。尽管在文库合成过程中发生了复杂的重排，但文库构建顺利进行，RaPID 选择产生了有效的大环肽。尽管这些肽的起源与它们的基因型序列不同，但它们具有共同的基序 RxRxxRIYRR，该基序部分与底物基序 RxRxR 相同，也与之前的 TMP 抑制剂基序 RxRxxR 相同。因此，文章认为 BMP-RaPID 选择与文章从硫醚大环肽文库中进行的标准 RaPID 选择效果相当。从文章的观点来看，理论上 BMP 在大环环中的可旋转键比 TMP 少，因此通过结合 N-甲基、d-、β-和γ-氨基酸的掺入，文章期望 BMP 的血清稳定性和可能的细胞膜通透性能够显著提高。文章将继续开展下一个挑战，即在这些库的制备以及针对目标蛋白的筛选方面的工作，以期直接从这些库中发现具有更优特性的大环化合物。

参考文献：DOI: 10.1002/anie.7837067