髓母细胞瘤是一种在儿童中诊断出的恶性脑瘤。化疗已将生存率提高到约70%；然而，儿童往往会长期受到治疗副作用的影响。需要开发出既能保持高治愈率又能降低脱靶毒性的新疗法。文章首次描述了利用噬菌体-肽展示文库来识别与髓母细胞瘤细胞结合的七肽。合成了两种分别表现出高[E1-3(1)]或低[E1-7(2)]髓母细胞瘤细胞结合亲和力的七肽。通过将E1-3(1)或E1-7(2)与阿霉素(5)偶联，研究了这些肽将治疗药物特异性递送至髓母细胞瘤细胞的潜力。两种肽-药物偶联物对髓母细胞瘤细胞均具有细胞毒性。E1-3阿霉素(3)能够渗透体外血脑屏障，并且与游离阿霉素(5)相比，在非肿瘤细胞中的细胞毒性显著降低。本研究为开发肽-药物偶联物以抑制髓母细胞瘤细胞生长同时将脱靶毒性降至最低提供了概念验证。
名称：E1-3
单字母 H2N-FSRPAFL-OH
多字母 H2N-Phe-Ser-Arg-Pro-Ala-Phe-Leu-OH
氨基酸个数 7
分子式 C41H60N10O9
平均分子量(MW) 836.98
文章描述了使用噬菌体展示文库来识别与髓母细胞瘤细胞结合的新型七肽。从这个筛选中，文章选择了两种肽进行进一步表征：一种对髓母细胞瘤细胞表现出高结合亲和力，而另一种具有低结合亲和力。两种肽（1和2）都已合成并与阿霉素(5)化学偶联。文章的结果表明，与游离药物相比，高结合肽(1)在与阿霉素(5)偶联时能够改变其进入髓母细胞瘤细胞的细胞内化方式。更重要的是，肽-阿霉素偶联物(3)可以穿透体外血脑屏障(BBB)并且与非肿瘤细胞相比，对髓母细胞瘤细胞表现出高度特异性。
文章研究了E1-3肽（1）是否能像穿膜肽（CPPs）那样使用，但对髓母细胞瘤细胞具有更高的特异性。阿霉素（5）是一种常见的化疗药物，对抑制肿瘤生长非常有效，但存在脱靶副作用，即心脏毒性。成熟的化学技术允许将肽直接与阿霉素（5）连接。文章通过化学方法将两种不同的七肽，即E1-3肽（1）和E1-7肽（2）与阿霉素（5）连接起来，这两种肽在文章的筛选中分别被鉴定为对髓母细胞瘤细胞具有高或低的结合亲和力。E1-3阿霉素共轭物（3）在暴露于血清蛋白时保持稳定，并在3小时内被髓母细胞瘤细胞内化到核周或细胞核内。E1-3阿霉素共轭物（3）的细胞内化方式与游离阿霉素（5）不同。游离（未连接）的阿霉素（5）能够通过细胞膜被动扩散进入细胞核，这从其迅速在细胞内定位中可以观察到。当用四种不同的、常用的内吞抑制剂对髓母细胞瘤细胞进行预处理时，对游离阿霉素（5）的摄取没有影响，这证实了这一点。相反，流式细胞术和荧光寿命成像分析表明，细胞松弛素D（一种已知的肌动蛋白细胞骨架重组和巨胞饮抑制剂）能够部分抑制或延缓E1-3阿霉素（3）在髓母细胞瘤细胞中的摄取和细胞内运输。巨胞饮通常被大纳米颗粒或药物偶联物用于进入肿瘤细胞。该途径可通过刺激细胞表面受体、蛋白聚糖或G蛋白偶联受体而被激活。与白蛋白偶联的药物，如白蛋白结合型紫杉醇（Abraxane），利用巨胞饮进入肿瘤细胞。未来的研究需要通过强制基因操作关键内吞基因并结合共聚焦显微镜，来全面阐明E1-3阿霉素（3）的细胞内化模式。
接下来，文章确定了E1-3阿霉素偶联物（3）对髓母细胞瘤细胞的细胞毒性活性、血脑屏障（BBB）通透性和特异性。首先，文章表明E1-3阿霉素（3）在处理72小时后对髓母细胞瘤细胞的细胞毒性作用与游离阿霉素（5）相似。E1-3阿霉素偶联物（3）的IC50值略高，这很可能是由于E1-3肽（1）在细胞内从阿霉素（5）上裂解需要额外的时间。先前的研究报告称，与阿霉素（5）偶联的肽需要在细胞内裂解，以便药物能够与DNA交联从而发挥其抗增殖作用。在文章的研究中，文章使用戊二酸酯连接子将E1-3七肽（1）与游离阿霉素（5）偶联。酯连接子被广泛用于生成肽药物偶联物，并已被证明在体外和体内都容易水解。其次，文章证明了E1-3阿霉素偶联物（3）能够使用经过验证的体外模型渗透完整的血脑屏障。此外，其渗透效率高于游离阿霉素（5）。这表明E1-3阿霉素偶联物（3）可能具有通过全身给药靶向髓母细胞瘤细胞的潜力。越来越多的小肽被报道能够通过受体介导的转胞吞作用（RMT）或吸附介导的转胞吞作用（AMT）穿过血脑屏障（BBB）。其中研究最为透彻的能穿透血脑屏障的肽是血管肽-2（ANG），它能与在脑中高表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白-1（LRP1）相互作用。该肽已被用于通过RMT将包括化疗药物在内的多种治疗药物转运过血脑屏障。实际上，与紫杉醇偶联的ANG（ANG1005）目前正在进行针对复发性脑转移乳腺癌患者的II期临床试验（NCT02048059）。通过AMT穿过血脑屏障的肽与诸如γ-氨基丁酸（GABA）之类的药物偶联时也被证明是有效的。未来的研究需要确定E1-3肽（1）与人脑内皮细胞相互作用从而穿过血脑屏障的机制。
最后，文章证明了E1-3阿霉素偶联物（3）对髓母细胞瘤细胞具有高度选择性，这从其细胞毒性活性高于E1-7阿霉素偶联物（4）中得到了证实。在文章的噬菌体筛选中，E1-7肽（2）被鉴定为与髓母细胞瘤细胞的结合亲和力较低。这表明E1-3肽（1）能够更有效地与髓母细胞瘤细胞表面表达的受体或蛋白质相互作用。重要的是，文章证明了当E1-3七肽（1）与阿霉素（5）偶联时，在暴露于两种不同的非肿瘤细胞类型（包括人脑星形胶质细胞）时，其细胞毒性活性会降低。这些发现支持了未来研究的合理性，旨在探索使用对流增强输送（CED）或鼻脑输送局部向脑内输送E1-3阿霉素偶联物（3）的潜力，以直接靶向髓母细胞瘤细胞，并在减少对周围健康细胞（如星形胶质细胞）的不良毒性的同时，输送高浓度的化疗药物。文章实验室正在研究旨在探究E1-3阿霉素偶联物（3）在临床相关的髓母细胞瘤小鼠模型中局部或全身给药时的生物稳定性和治疗效果的研究。
参考文献：doi.org/10.1021/acs.jmedchem.9b00851
