即事先将需要磷酸化的氨基酸（Thr,Ser或Tyr）磷酸化并适当保护，然后按照正常SPPS合成流程将磷酸化单体缩合到多肽指定位点。这种方法操作简便，已经成为多肽单位点磷酸化修饰的主要方法。
2）多肽序列在树脂上合成完后，再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化：
采用将磷酸化单体缩合到多肽中的方法进行磷酸化修饰时，磷酸化的氨基酸由于侧链修饰的较大基团产生的位阻而导致难以与肽链缩合，并且之后的氨基酸引入都会比较困难，尤其在含有多个磷酸化位点修饰时，合成将变得异常困难，并且最终产物成分复杂，难以分离，产率极低。
因此，当肽链中多个位点进行磷酸化时，可以考虑采用将多肽序列在树脂上合成完后，再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化：其合成过程主要就是在多肽合成结束之后，选择性的脱去要标记氨基酸的侧链保护基，对于Tyr，Thr可以直接使用侧链不保护的氨基酸进行反应。
侧链保护基在1%TFA/DCM条件下可以定量的脱除。采用这种方法时，可以采用双苄基亚磷酰胺，四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体，连接到羟基上，然后在过氧酸条件下氧化生成磷酰基，完成反应。
