肽为靶向具有挑战性的药物靶点（例如细胞内蛋白质-蛋白质相互作用，protein-protein interaction, PPI）提供了一种颇具吸引力的药物形式。遗憾的是，肽通常不能透过细胞膜，并且在体内天生易被蛋白酶解（proteolysis）降解。肽的大环化（macrocyclization）极大地提高了其蛋白酶解稳定性，在某些情况下还提高了其细胞穿透（cell-penetrating）活性。将肽基货物（peptidyl cargo）与环状细胞穿透肽（cyclic cell-penetrating peptide）缀合，已产生了针对细胞内蛋白质靶点的高效、细胞可渗透且代谢稳定的大环肽。肽基货物与环状细胞穿透肽的正确缀合/整合，对于保留各组分的活性并产生具有生物活性的大环肽至关重要。本章描述了已开发的不同缀合策略［包括内环（endocyclic）、双环（bicyclic）和可逆环化（reversible cyclization）方法］及其制备的详细操作方案。

肽已成为一种前景广阔的新药物形式，因为它们能够重现蛋白质优异的亲和力和选择性，同时又保留小分子的某些属性（例如合成的可及性、较低的生产成本以及较低的免疫应答风险）[6]。然而，传统肽类治疗药物存在该类药物固有的问题，例如体内快速的蛋白酶解降解和缺乏细胞渗透性 [7]。为了提高肽的代谢稳定性（metabolic stability），研究者探索了多种大环化方法以及非天然氨基酸的引入 [7]。一般而言，小环和中环环肽（≤10 aa）对蛋白酶解降解具有相对的抗性。其中一些环肽已经成为成功的治疗药物、临床候选物和/或有价值的生物学探针，包括环状 RGD 肽 [8]、二硫键环化的利那洛肽（linaclotide）[9]，以及针对 MDM2-p53 相互作用的碳氢钉合肽（hydrocarbon-stapled peptide）[10]。一项正在进行且更具挑战性的工作，是提高肽（包括环肽）的细胞渗透性。广义而言，研究者一直在追求两种不同的策略来设计细胞渗透性环肽，它们对应两种不同的细胞进入机制：被动扩散与内吞作用（endocytosis）。本章聚焦于后一种策略，即将肽基货物与细胞穿透肽（cell-penetrating peptide, CPP）缀合或整合。

1 环状细胞穿透肽

20 世纪 90 年代初，Tat 肽（源自 HIV 转录反式激活因子蛋白）被发现具有细胞穿透肽的功能，从而催生了一个新领域 [11, 12]。此后，大量 CPP 被发现，包括九聚精氨酸（nonaarginine, R9）和 penetratin（Antp），并已被用于在体外和体内递送种类繁多的货物 。然而，线性 CPP 遇到了若干挑战，迄今为止阻碍了它们的临床转化 ，包括快速的蛋白酶解降解和较差的药代动力学性质、缺乏生物分布（biodistribution），以及胞质递送效率低下。为了克服这些挑战，Pei 及其同事探索了以环肽作为 CPP，并发现 cyclo(Phe-Nal-Arg-Arg-Arg-Arg-Gln)（环状 CPP1，其中 Nal 为 L-2-萘丙氨酸）是一种显著改进的 CPP（图 1）。除具有优异的蛋白酶解稳定性外，CPP1 的胞质递送效率比 Tat、R9 和 Antp 高 3~12 倍。随后的构效关系（SAR）研究与优化促成了环状 CPP9［cyclo(phe-Nal-Arg-arg-Arg-arg-Gln)］和 CPP12［cyclo(Phe-phe-Nal-Arg-arg-Arg-arg-Gln)］的发现，它们具有异常高的活性，胞质递送效率分别为 62% 和 120%（100% 定义为细胞外培养基与胞质中的货物浓度相等）。相比之下，在相同测定条件下，Tat 和 R9 的胞质递送效率分别为 2.0% 和 4.4%。环状 CPP 直接与细胞质膜（plasma membrane）的磷脂结合，并通过内吞作用进入细胞。进入早期内体后，环状 CPP 与内体膜结合，诱导膜弯曲，并使富含 CPP 的小囊泡向胞质内出芽。随后，这些不稳定囊泡的塌陷导致囊泡内容物（包括 CPP）释放到胞质中。

2 肽基货物与环状 CPP 的整合

环状 CPP 本身没有已知的生物学活性；其价值在于能够将具有生物活性但不能透过膜的货物递送到哺乳动物细胞的胞质中。其作用机制预示，环状 CPP 应当与货物无关（cargo agnostic），尽管货物的性质可通过若干不同机制影响细胞进入效率。例如，货物可与细胞质膜结合，从而增强 CPP-货物缀合物的内吞摄取（uptake）；或与内体膜结合，从而增强缀合物的内体逃逸（endosomal escape）。货物可能增加或减少循环过程中环状 CPP 与血清蛋白的结合，从而影响细胞摄取动力学和/或效率。最后，货物可能以分子内或分子间的方式与 CPP 发生物理相互作用，从而降低环状 CPP 或货物的活性。因此，将给定货物与环状 CPP 进行正确的缀合，对于确保 CPP 和/或货物的活性得以维持、或在某些情况下得以增强至关重要。迄今为止，环状 CPP 已成功用于递送小分子（例如荧光染料）、线性肽、环肽、蛋白质和核酸 [21]。下面，我们描述已开发的、用于将环状 CPP 与肽基货物缀合的不同策略，包括内环缀合（endocyclic）、外环缀合（exocyclic）、双环缀合（bicyclic）和可逆环化递送方法（图 2）。

2.1 内环缀合

内环缀合是将货物序列直接插入环状 CPP 环中，所得缀合物为单环肽 。该缀合方法仅限于相对较小的货物（即 ≤5 aa 的肽）。较长的肽货物会形成更大的环，其细胞进入效率逐渐变差，这很可能是因为构象柔性的增加削弱了大环化所提供的熵优势。由于靶标结合序列与 CPP 序列位于同一环内，带负电荷的货物序列可能与阳离子型 CPP 发生静电相互作用，从而对细胞摄取效率产生负面影响。另一方面，货物序列与 CPP 序列的邻近性，使得设计下述环肽成为可能：其中同一个（或几个）残基兼具细胞进入和靶标结合的双重功能。这可显著减小大环的尺寸，使其更加"类药"。利用该策略，Bedewy 等人设计了一种针对肽基-脯氨酰顺反异构酶 Pin1 的环七肽抑制剂（图 3a）。尽管存在一个带负电荷的磷酸-D-苏氨酸作为关键的 Pin1 结合基序，该大环仍具有细胞渗透性，并在 HeLa 细胞中抑制了 Pin1 的活性。据我们所知，这是已报道的、通过内吞机制进入哺乳动物细胞并引发生物学活性的最小大环肽。Upadhyaya 等人通过整合 CPP 样基序与随机化肽序列，设计了一个单环肽组合库。针对与 G12V 突变型 K-Ras 的结合对该库进行筛选，随后加以优化，得到了一种高效的、细胞可渗透的环十一肽 K-Ras 抑制剂，它选择性地阻断 Ras-GTP 与其下游效应蛋白（如 Raf 和 PI3 激酶）的结合，并诱导突变型 K-Ras 驱动的癌细胞凋亡。

2.2 双环缀合

当具有生物活性的货物本身也是环肽时，可以将该环肽与环状 CPP 融合，形成双环肽，其中一个环确保高效的细胞进入，而另一个环结合目标靶点（即双环缀合）。一种简单而又通用、高效的两环化方法是：将 CPP 序列与货物序列融合，形成一条含有两个带侧链胺基氨基酸［例如赖氨酸或 2,3-二氨基丙酸（Dap）］的线性肽，其中一个位于 C 端，另一个位于 CPP-货物连接处。然后，通过使 N 端胺基与两个侧链胺基同均苯三甲酸（trimesic acid）反应，将该肽转化为双环肽（图 2c）。这种刚性支架有助于将肽预组织为有效的结合构象，从而提高其对蛋白质靶点的结合亲和力和特异性。该平面支架还使 CPP 环与货物环彼此背离排布，将其相互干扰降至最低。最重要的是，双环缀合原则上可以容纳任何尺寸或序列的货物，因为货物环的改变不影响 CPP 环或其细胞进入效率。利用该策略，Jiang 和 Pei 设计了一个双环肽库，旨在寻找一种高效、细胞可渗透的非磷酸化双环肽 Pin1 抑制剂 。在该库中，双环肽的一个环带有固定的 CPP 基序，而另一个环由简并肽序列组成（图 2c）。针对 Pin1 筛选该库，鉴定出一种高效且高选择性的 Pin1 抑制剂（图 3b），其以 KD = 0.12 μM 与 Pin1 结合，并在人癌细胞中抑制 Pin1 活性。该文库方法还被用于发现针对蛋白酪氨酸磷酸酶 1B 和 TCPTP 以及 K-Ras的、具有细胞渗透性和生物活性的抑制剂。

2.3 可逆环化

对于某些靶蛋白（例如 PDZ 结构域），肽配体必须呈线性、伸展的形式才具有生物活性。这类线性肽基货物既不适合内环缀合方法，也不适合双环缀合方法。简单地将线性肽缀合到环状 CPP 的侧链上往往是不够的，因为线性肽（尤其是那些主要由蛋白源性氨基酸组成的线性肽）在体内易被快速蛋白酶解降解。为此，Qian 等人提出了一种可逆环化策略，可同时提高线性肽货物的蛋白酶解稳定性和细胞渗透性 [28]。在该策略中，CPP 序列与肽基货物序列融合，并通过二硫键环化。环化同时提高了抗蛋白酶解能力和细胞摄取效率。一旦成功进入胞质，二硫键即被细胞内硫醇还原，释放出具有生物活性的线性肽，以结合所需的细胞内靶点（图 2d）。Qian 等人已应用该策略制备出用于实时检测细胞内半胱天冬酶（caspase）活性的细胞渗透性肽底物。同一研究团队还开发了一种二硫键环化的肽基抑制剂，靶向 CFTR 相关配体 CAL-PDZ 结构域，作为囊性纤维化的潜在治疗手段（图 4a）。

2.4 可逆双环化

与内环缀合类似，CPP-货物融合肽的二硫键介导环化也限于相对较小的环尺寸。可逆双环化为向大环肽引入额外构象刚性提供了另一种途径。Qian 等人通过设计一种针对 NF-κB 必需调节因子（NEMO）的细胞渗透性抑制剂，首次证明了该策略。他们将 IκB 激酶 β 的 NEMO 结合结构域（NBD）（ALDWSWLQ）与一个短 CPP 基序（RRRRΦF，其中 Φ 为 2-萘丙氨酸）融合，并加入两个半胱氨酸残基，一个位于 C 端，另一个位于 NBD 与 CPP 序列之间。所得肽通过在半胱氨酸与 N 端 3,5-双(巯基甲基)苯甲酰基（3,5-bis(mercaptomethyl)benzoyl）基团之间形成两对二硫键，从而环化为双环（图 4b）。与单环肽相比，双环化将每个环的尺寸减小到原尺寸的约二分之一，大大提高了大环的构象刚性。这进而大幅提高了细胞摄取效率以及抗蛋白酶解能力。该双环 NEMO 抑制剂阻断了 NEMO 与 IκB 激酶之间的相互作用，并在细胞培养中抑制了 TNFα 诱导的 NF-κB 信号转导。

结论与未来方向

尽管并非本文的重点，过去十余年间已发展出若干强大的组合文库技术，可用于产生针对几乎任何蛋白质靶点、具有抗体样亲和力和特异性的大环肽配体。环状 CPP 作为强效细胞内递送载体的近期发现，现已使将这些大环肽配体递送到哺乳动物细胞的胞质和细胞核成为可能。此外，正如本文所涵盖的实例所示，这两种平台技术（文库筛选和环状 CPP）可以整合，以快速发现高效、特异、细胞可渗透且代谢稳定的大环肽，用于调控当前药物形式（即小分子和生物药）无法成靶的细胞内靶点。这些进展开创了肽类治疗药物的新时代，肽很可能成为第三大主要药物形式，占据分子量 500~5000 之间这片广阔而目前荒芜的地带。这些大环肽也将为生物学和生物医学研究提供强有力的工具化合物。

为充分实现大环肽作为第三大主要药物形式的潜力，我们认为以下领域的研究至关重要。首先，我们需要在机制上更好地理解环状 CPP（以及一般而言的 CPP）如何实现胞质进入。这一认识将有助于预测这类新型分子在体内的行为，并进一步改进 CPP。其次，需要对这类化合物的药代动力学、细胞毒性和免疫原性活性进行系统评价，尤其是因为较差的 PK 性质在过去被认为是肽类药物最主要的局限。最后，大环肽的合成化学在药物化学和工艺化学两个阶段都需要显著改进。特别是，大量价格可承受的非蛋白源性氨基酸的商业化供应，将极大地促进先导化合物优化工作。