环肽（cyclic peptide）最令人振奋的特征之一，是它们尽管具有远超传统"五倍法则"（Rule-of-5）化学空间的物理性质，却仍具备口服生物利用度的潜力。应对这一挑战的一个重要环节，是设计具有良好肠道渗透性（intestinal permeability）的环肽。本文讨论近年来发展起来的一系列肠道渗透性设计原理。这些原理可细分为三个层面：物理性质指导原则、大环（macrocycle）骨架的设计策略，以及侧链（side chain）的设计策略。总体而言，最重要的目标是使溶剂暴露（solvent-exposed）的极性最小化，同时将分子大小、柔性（flexibility）和亲脂性维持在有利的范围内，从而使肽化学家在获得肠道渗透性的同时，还能兼顾化合物的其他重要性质，如溶解性（solubility）和结合亲和力（binding affinity）。本文描述了为帮助肽化学家实现这一目标而发展起来的多种设计策略。

近期利用 PAMPA 试验分析大量环肽渗透性的文献包括：一项针对 39 个环肽天然产物的研究、一项针对 62 个设计环肽的研究，以及采用裂分-混合（split-pool）技术合成的环肽或 Peptomer（肽/类肽杂合体）文库的更大规模研究。其中针对 62 个环肽的研究还使用了 Caco-2 试验，并分析了该组化合物中 PAMPA 与 Caco-2 之间的相关性。其他近期使用 Caco-2 的研究包括：54 个环六肽中多重 N-甲基化影响的分析、顺式（cis）肽键作用的研究，以及若干改善细胞渗透性设计方法的分析。MDCK-LE（或 RRCK）试验已被用于若干针对性研究，包括环六肽 N-甲基化的研究、环六肽侧链取代的研究，以及一种口服可吸收的 CXCR7 肽-类肽杂合体的发现。表 1 列出了若干近期报道的大鼠口服生物利用度高于 15% 并给出 MDCK-LE 测定值的多肽。对于这些化合物，其 MDCK-LE 表观渗透系数（Papp）通常大于 4 × 10⁻⁶ cm/s。

3 基本物理性质

如果能有简便的性质指导原则，可在设计过程中轻松评估，那么设计具有良好肠道渗透性的环肽将会大为便利。近 20 年前，Lipinski 的"五倍法则"使这类面向药物化学合成的指导原则广为人知，该法则强调分子量、logP 以及氢键供体和受体是决定口服生物利用度的关键性质。随后 Veber 等的工作则强调了低极性表面积和可旋转键数目对于口服生物利用度的重要性。更近期，Varma 等得以将影响吸收的因素与影响逃避肠壁及肝脏代谢的因素区分开来。大多数历史性的指导原则——特别是关于分子量、极性表面积、氢键供体与受体以及可旋转键数目的那些——主要都与吸收相关，唯一的例外是过高的 logP。高 logP 之所以主要不利于生物利用度，是因为它会导致肠壁代谢和肝脏代谢的增加。logP 与吸收或渗透性之间的关系则更为复杂。高 logP 通常不利于溶解性，而溶解性是吸收中的一个重要因素；然而 Varma 等的工作并未发现 logP 对总体吸收有显著影响。

环孢素 A远远超出"五倍法则"的性质指导范围，却具有显著的口服生物利用度，这提示可能存在另一种性质空间，用以界定环肽渗透性和口服生物利用度的指导原则。最近一项针对分子量 > 500 的已上市药物和临床候选药物的分析，鉴定出一个"有可能口服（possible to be oral）"的性质空间，其性质指导范围大大放宽，例如分子量 < 1000、拓扑极性表面积 < 250 Ų。与此一致的是，一项针对采用裂分-混合方法合成的环肽文库的分析显示，分子量 > 1000 的化合物其渗透性出现急剧下降。有趣的是，尽管"有可能口服"性质空间相对于五倍法则大幅提高了大多数性质的阈值，但氢键供体数目（HBD ≤ 6）的指导阈值提高得极少，这凸显出在追求渗透性和口服生物利用度的过程中，保持氢键供体数目处于低位具有至高无上的重要性。

另一种已被提出的可能性是：三维性质将成为超越五倍法则（beyond the Rule-of-5）领域的根本衡量标尺；而对环肽这类分子的构象进行充分表征，可以确定渗透性的三维性质指导原则：三维极性表面积 < 100 Ų，回转半径 < 7 Å。也有可能需要更为严格的分析，人们已经开发出复杂的计算方法用于预测环肽的渗透性，例如 Leung 等的基于物理学的方法。

尽管这类计算模型前景可观，但要准确模拟环肽这样复杂分子的相关三维构象仍然具有挑战性。测量有效极性的实验方法因此极为重要，而对环肽设计领域或许最有价值的是 EPSA。EPSA 是一种实验性的色谱方法，所报告的极性数值类似于极性表面积。最初的指导原则是：对于环肽而言，当 EPSA < 90 时，获得被动渗透性的可能性要大得多。值得注意的是，表 1 中那些口服可吸收的环肽都远低于这一阈值。最近，在一大组针对 CXCR7 设计的环肽中，这一指导原则再次得到验证（见图 1 左）。应当指出的是，EPSA 值低于 90 并不能保证良好的渗透性，但它确实能显著改善化合物的前景。

低极性（EPSA < 90）为何不能保证良好的渗透性，目前尚未完全明了。一个明显的因素是 logP 值落在了最佳范围之外（见图 1 右）。如果 logP 值过高，可能会干扰渗透性的测定，因为化合物会滞留在初始孔中，或者溶解性特别差。这也可能代表生理渗透性出现了真实的下降，因为化合物会卡在膜的疏水内部。过低 logP 值同样不利于渗透性，因为这类化合物相对极性较大。在 CXCR7 的研究中，一些 EPSA 较低的化合物其 ClogP 也低于最佳范围，并且渗透性很差[，这或许提示 EPSA 低估了这些化合物的真实极性。一个可能具有普遍性的原理是：大多数环肽系列都会存在最佳的 logP 范围，过高和过低的 logP 值都不利于渗透性。

另一项备受关注的性质是分子柔性。尽管可旋转键数目常常被强调为出于渗透性和口服生物利用度考虑而需要最小化的一个重要性质，其在环肽中的适用性却颇为复杂。这种复杂性主要源于这样一种可能性：柔性的增加可能使环肽采取交替变换的构象，其中一些构象极性极小、有利于渗透，而另一些构象则动态地暴露极性，从而有利于水溶性。在一项近期研究[9]中，环六肽的刚性（rigidity）被发现有利于渗透性和口服生物利用度；而另一些研究则发现柔性是有利的，它使环肽能够同时采取可渗透的构象和可溶的构象。柔性与刚性的价值很可能高度依赖于具体情形，取决于所能够采取的具体构象的性质。一项旨在鉴定肠道可渗透且口服可吸收环肽的设计工作，大概会从同时探索柔性类似物和刚性类似物中获益。

总而言之，这些性质分析凸显了以下工作的价值：使分子的有效表面极性最小化，从而使其能够分配进入膜中；以及使分子的有效体积最小化，从而降低跨膜扩散的壁垒。此外，探索一定范围的 logP 并监测其影响也是有价值的，因为理想范围可能因具体系列而异，而且它很可能既影响实验的准确性，也影响清除率等互补的生理性质。同样，柔性的影响也应加以探索，因为它对渗透性以及溶解性和口服生物利用度等其他重要性质的影响很可能是因情形而异的。

4 大环骨架的设计策略

人们已经探索了多种环肽设计策略，其目的在于通过获得有利的性质——最显著的是降低表面极性，尤其是溶剂暴露的氢键供体——来改善环肽的肠道渗透性。在药物发现的背景下，这些性质需要与效价和清除率等其他相互竞争的性质加以平衡。这些设计策略可分为主要改变大环骨架的一类（见表 2）和改变侧链的一类（见表 3）。

值得注意的是，与无环（acyclic）类似物相比，环化本身就提供了某些固有的优势。环化有助于提高抗蛋白酶解稳定性，而这对于口服吸收和生物利用度是必不可少的。环化也有助于渗透性本身。这一点在线性与环状类似物的直接比较中表现得最为清楚。十肽的比较颇具启发性：环状（表 1 中的化合物 4）与无环类似物的 EPSA 非常接近（61 对 66），计算极性也很接近，但 MDCK-LE 渗透性却相差悬殊（5.4 × 10⁻⁶ cm/s 对 0.6 × 10⁻⁶ cm/s）。这些数据可能表明，由 EPSA 所指示的那种最佳低极性构象，环状体系要比无环体系容易采取得多。可以预期，高度柔性的无环分子会采取数量多得多的、更为松散且极性更大的构象，从而为采取可渗透构象制造了一道熵屏障（entropic barrier）。

造成多肽高极性和低渗透性的最重要因素之一，是肽键上的 NH 基团，尤其是那些暴露于溶剂的 NH。这些基团与水发生有利的相互作用，使得多肽倾向于水合状态，而不是膜渗透状态。对这些肽键氮原子进行甲基化，是改善环肽渗透性最早、也是研究最充分的设计方法之一，其部分灵感来自十一肽环孢素 A 中存在的七个 N-甲基。选择对哪些酰胺进行甲基化是复杂的，因为溶剂暴露程度取决于多肽的三维结构，而且一个多肽可能采取多种构象。最值得注意的是，环孢素 A 本身就能随环境不同而采取差异极大的构象。更进一步的复杂性来自：相对于未甲基化的类似物，N-甲基有可能改变主链（backbone）构象，并且不同的 N-甲基化模式会产生不同的构象。另一个需要考虑的因素是，某个特定的 NH 有可能参与了关键的受体相互作用，而甲基化可能不利于受体亲和力（例如在 CXCR7 中）。

最早的若干研究涉及关键多肽的系统性 N-甲基化，这些研究成功找到了能够改善渗透性的特定 N-甲基和/或 N-甲基化模式。文献[5]描述了一种更具针对性的方法，其中既包括实验性的固载树脂上（on-resin）N-甲基化，也包括对可能的立体化学选项和 N-甲基化模式的计算虚拟文库分析。这项工作最终鉴定出了化合物 1（表 1），其大鼠口服生物利用度达到 28%。该工作凸显了构象与 N-甲基化之间的相互作用：N-甲基化对若干骨架具有选择性，而研究最充分的选择性甲基化多肽，其渗透性优于其全甲基化（permethylated）或未甲基化的类似物。

N-甲基化肽键的一个不寻常的结构特征是，它们能够远比标准的未甲基化肽键更容易地采取顺式（cis）构象。最近一项针对 13 个 N-甲基化环五丙氨酸多肽的研究发现，在大多数渗透性较好的多肽中都存在顺式肽键。该研究提出的一个有趣可能性是：顺式肽单元充当了载体介导 Caco-2 转运的识别元件，这一点此前在一项对映异构体对的研究中也曾观察到。

可渗透环肽主链的另一个重要设计原理，是形成分子内氢键（intramolecular hydrogen bond, IMHB）。这已被提出是多肽渗透性的一个有利特征，甚至是在超越五倍法则（bRo5）化学空间中实现渗透性和吸收的通用设计策略[38]，其部分依据是在非极性溶剂中观察到环孢素 A 存在多个分子内氢键，而这些氢键据推测也存在于其膜渗透构象中。一项针对为最大化 IMHB 数目而设计的九个环肽非对映异构体（diastereomer）的分析[33]发现，其中渗透性最好的那个形成了两个强的跨环（transannular）分子内氢键。参与这些稳定的跨环分子内氢键的 NH 被有效地屏蔽于水之外，使得该多肽即使没有任何一个肽酰胺被 N-甲基化，也具有良好的被动渗透性。分子内氢键的存在及其重要性还在多篇文献中被提及，包括[5, 7, 9–11, 17, 34]。

大环骨架的立体化学至关重要，因为不同的非对映异构体会具有不同的优选主链构象、不同的分子内氢键合模式以及不同的渗透性。同样地，由于其构象偏好不同，不同的非对映异构体可能具有不同的有利 N-甲基化模式。所幸的是，人们发现计算模型能够有效地评估各种可能的非对映异构体、N-甲基化模式和 IMHB 模式，并有助于梳理、预测和解读这些复杂的相互关系。

脯氨酸残基可能尤为可贵，并且在口服生物利用度良好的环肽中频繁出现。实例包括表 1 中的化合物 1、2、3 和 5。脯氨酸有利的原因有几方面：它们消除一个 NH；它们能够迫使形成转角（turn）构象并稳定分子内氢键合；它们还能增加多肽的刚性。最近一项研究将化合物 1 与通过减少或增加脯氨酸数目而得到的类似物进行了比较。不含脯氨酸的类似物（化合物 1 中的 D-Pro 被 D-Leu 替换）在溶液中不形成分子内氢键；而含有两个脯氨酸的类似物（化合物 1 中的 D-Leu 被 D-Pro 替换）保持了分子内氢键合，甚至在大鼠口服生物利用度上还显示出小幅改善。

除了对酰胺氮进行甲基化，或让酰胺 NH 参与分子内氢键合之外，还可以用噻唑或噁唑啉等杂环来替代肽键，从而消除其中一个氢键供体。噻唑偶尔见于天然产物多肽中，例如 sanguinamide A，其大鼠口服生物利用度为 7%。表 1 中的化合物 2 是 sanguinamide A 的一个后续化合物，它保留了噻唑，同时引入了进一步改善渗透性和口服生物利用度的其他修饰。另一个以 PAMPA 测得渗透性良好的天然产物实例是 patellamide C，其大环骨架中含有两个噻唑和两个噁唑啉。

一项相关的降低氢键供体数目的策略是采用缩肽（depsipeptide）。缩肽是指肽酰胺键被酯键替代的多肽；如果一个溶剂暴露的氢键供体（NH）被氢键受体（O）所取代，则有利于渗透性。在最近一项针对 39 个环肽天然产物的研究中，缩肽在渗透性较好的多肽中频繁出现，其中包括 enniatin B 和 guongomide A。

近年来，肽环的若干其他变体也被成功应用。文献[8]将 statine（他汀类氨基酸）引入环肽，所得化合物相较于不含 statine 的类似物显示出改善的水溶性和微粒体稳定性（microsomal stability）。此外，这些化合物具有高度的分子内氢键合，并且以 EPSA 测得的暴露极性格外之低。表 1 中的化合物 3 即为一例，尽管存在两个羟基，它仍具有良好的大鼠口服生物利用度（20.7%）和极低的 EPSA（57）。

更近期，环丙烷系链（cyclopropane tether）被引入环肽，取得了非常可喜的结果。环丙烷系链极大地限制了环的构象，并且因环丙基的顺式或反式立体化学以及相邻中心的立体化学不同而产生巨大差异，从而使化学家能够生成多种多样的形状。所合成的该系列化合物表现出范围很广的渗透性和 EPSA 数值。其中最好的化合物含有一个 cis-NfCf单元，相对于母体环肽使 EPSA 降低了 15 个单位。进一步进行 N-甲基化后，最佳多肽在猪肾上皮细胞渗透性试验中达到了 12.7 × 10⁻⁶ cm/s 的优异渗透性。

5 侧链的设计策略

尽管环肽渗透性的设计策略主要集中在环骨架本身，侧链的选择也可以产生巨大的影响[6]。两条总体性的策略是：采用非极性或弱极性的侧链；以及在可能的情况下使用支链侧链，以屏蔽主链的部分极性。表 3 列出了已经发展出来的各种策略。可渗透的多肽除了前文提到的脯氨酸之外，常常还含有小的非极性侧链，如丙氨酸和亮氨酸（见表 1 中的化合物 1、3 和 4）。然而在药物发现的背景下，可能需要使用种类更为多样的侧链，以满足诸如与靶标的结合亲和力等其他重要目标（见化合物 5 及文献[10]）。

一项针对化合物 1 的 16 个类似物的研究中，这些类似物仅在单个氨基酸侧链上有差异，且同时包含天然氨基酸和非天然氨基酸，结果显示其渗透性和清除率数值差异极大。对于这组类似物，微粒体清除率与 logD 之间有良好的相关性，RRCK 渗透性与 logD 之间也是如此，只不过作用方向相反。logD 较高的化合物通常渗透性更好，但清除率更高。两个例外是色氨酸和环己基丙氨酸，它们尽管 logD 很高，渗透性却很差。这些例外可能是由于 RRCK 试验中回收率（recovery）差[6]，也可能提示这些氨基酸确实会降低渗透性，正如色氨酸在别处所观察到的那样。该研究表明，即使只有一个可电离基团（Asp 或 Lys 氨基酸），也会显著降低渗透性和口服生物利用度；而中等大小的疏水侧链（Leu、Ile、Phe）对于渗透性格外有利。弱极性的苏氨酸侧链则引人注目：它能够在渗透性和清除率之间取得良好平衡，并且尽管引入了第二个极性基团，仍得到了一个大鼠生物利用度非常好（23.8%）的化合物。含有多个极性侧链却仍具有良好口服生物利用度的环肽相对少见。例如，表 1 中的化合物各自都只有零个或一个极性侧链。

另一种在保留多个极性侧链的同时实现良好渗透性的方法，是对这些侧链进行甲基化。对丝氨酸、酪氨酸和赖氨酸等极性侧链进行甲基化可能是有利的，因为这样既消除了氢键供体，又没有完全消除极性，也没有显著增大化合物的体积。如果出于与靶标结合亲和力的考虑而需要在侧链中保留极性，那么这种方法在药物发现中可能是有益的。也值得探索其他选择。在文献[10]中，一个可电离氨基酸（Arg）被吡啶基丙氨酸和噻唑基丙氨酸等中等极性的杂环氨基酸所替换，从而大幅改善了 EPSA，同时保持了良好的结合亲和力。该研究还显示了替换色氨酸侧链的潜在价值。用体积庞大但非芳香性的叔丁基丙氨酸（t-butyl alanine）替换色氨酸，对渗透性格外有利，并且保持了良好的靶标效价。

一般而言，叔丁基丙氨酸和叔丁基甘氨酸（t-butyl glycine）等支链侧链往往有利于渗透性，因为其空间体积能够屏蔽主链 NH 基团免受溶剂作用。化合物 2 和 5 即为实例。这种效应也可以推广到苏氨酸，使其成为丝氨酸的有益替代，如文献[6]所示。尽管叔丁基甘氨酸的支化点紧邻主链，但在 β 碳上的支化，其改善渗透性的效果未必优于在 γ 碳上的支化（如亮氨酸、异亮氨酸或叔丁基丙氨酸）。一项针对 17 个 sanguinamide A 类似物的研究[30]发现，用亮氨酸替换叔丁基甘氨酸可增加主链的柔性，并显著提高溶解性，同时保持、甚至可能改善渗透性。

另一个值得考虑的设计选项，是在一个或多个位置用类肽（peptoid）替代氨基酸。类肽的侧链位于甘氨酸的氮原子上，而不是 α 碳上，因而可以利用种类极其繁多的伯胺来实现结构的多样化。类肽消除了一个酰胺 NH，并增加了主链柔性，这两点在理论上都是有利的。最近一项系统性研究发现，类肽与其对应的多肽具有非常相近的渗透性，但类肽侧链更大的多样性使得人们有可能找到渗透性改善的类似物。这一点在文献[10]中得到了极为有效的运用：类肽侧链的巨大多样性被用来鉴定结合亲和力显著改善的化合物，并最终得到了一个强效且口服可吸收的肽-类肽杂合体（见化合物 5）。

6 小结

目前已有许多可用于改善环肽肠道渗透性的设计策略。尽管多肽构象柔性的复杂性使得人们难以确定地预测哪些策略会奏效，但通过主链和侧链修饰来降低极性——尤其是降低氢键供体——这一总体性策略通常是有效的。大环骨架上溶剂暴露氢键供体的减少乃至消除，通常是由分子内氢键合和肽键的 N-烷基化所驱动的。采用非极性或中等极性的侧链通常也有利于获得最佳渗透性，采用能够屏蔽肽主链部分极性的支链侧链同样如此。新的认识和新的设计策略，例如类肽[36]或环丙基系链[35]的应用，也显示出可观的前景。有少数设计原理，如引入柔性或选择最佳 logP 范围，其权衡取舍更为微妙，应当在为肠道渗透性以及其他重要性质而优化化合物的过程中加以探索。