大脑与身体其他所有重要器官一样，需要营养物质和气体才能正常运作。它受到三层脑膜的保护，这些脑膜可防止血脑屏障（BBB）过度暴露于钾、谷氨酸和甘氨酸等物质，因为这些物质在浓度升高时可能对神经产生毒性。由于拥有广泛的毛细血管网络，血脑屏障被认为是调节药物分子进入脑实质的重要屏障。紧密连接（TJs）和黏附连接（AJs）是血脑屏障中两种主要的连接复合体，通过连接脑毛细血管内皮细胞之间的旁细胞通路，调控物质的流入和流出。除了血脑屏障外，血液-脑脊液屏障（BCSFB）、室周器官屏障（CVOB）以及蛛网膜屏障（AB）还能过滤掉大小不同的药物分子，约98%的药物均被这些屏障阻隔。通常情况下，大多数药物无法进入大脑，而是通过脑脊液返回血液的途径，或经由脑实质细胞中的转运蛋白被清除。细胞外基底膜、与星形胶质细胞（ACs）和周细胞（PCs）相连的内皮细胞（ECs）层以及小胶质细胞共同构成了血脑屏障（BBB）的神经血管单元（NVUs），可阻止药物进入中枢神经系统。通过静脉途径给药的药物无法穿过NVUs，这至今仍是一个难题。

已知有多种运输方式可使药物分子、脂溶性小分子、弱碱及电中性溶质被动扩散穿过血脑屏障（BBB），如图1所示。能够被动扩散穿过BBB的药物分子通常应具有小于400 Da的分子量、良好的脂溶性、辛醇-水分配系数的对数值（logPo/w）在5至6之间，且氢键供体基团少于8个。这种被动扩散可通过细胞间隙（旁细胞途径）或穿越细胞内部（跨细胞途径）来转运营养物质或药物。遗憾的是，研究发现，超过98%靶向中枢神经系统的药物无法在最低治疗浓度下穿过BBB。因此，细胞穿透肽（CPPs）和归巢肽被视为有望突破BBB的新策略，从而改善药物向中枢神经系统递送的效果。

2 穿膜肽作为穿越血脑屏障的递送系统
CPPs 是一种基于肽的药物递送系统，有望实现将药物递送至大脑的目标。这些由天然氨基酸构成的小型合成肽载体能够促进多种小分子穿过血脑屏障。这些天然肽来源于多种渠道，包括 HIV 蛋白（TAT、RI-OR2-TAT）、狂犬病毒（RVG-29）、噬菌体受体（Pep-22、TGN、G23、T7、THR）、毒液神经毒素（Apanin、MinApa4）以及具有神经营养特性的内源性肽（调控多肽、RAP、angiopep-2）。值得注意的是，尽管这些化合物本身具有高度致病性或毒性，但据报道它们对神经细胞无毒性。

尽管细胞穿透肽（CPPs）进入哺乳动物细胞的能力已被广泛研究，但关于其跨细胞特性的相关研究却寥寥无几。一项针对人结肠癌细胞系Caco-2的研究，考察了三种不同CPPs——即Transportan、Penetratin和TP-10——穿过质膜的差异性渗透情况，结果表明，Transportan及其类似物TP-10主要通过跨细胞机制穿越细胞膜。对Tat蛋白进行的类似研究发现，在高度分化的上皮细胞系（如Caco-2和MDCK）中存在质膜渗透屏障，而在HeLa细胞中则不存在该屏障。针对此类肽类进行的血脑屏障（BBB）转运研究表明，细胞穿透水平波动较大，其中Tat碱性蛋白的细胞内摄取程度明显高于Transportan肽。此外，研究还揭示，CPPs单纯的细胞穿透能力并不能说明其具备穿越血脑屏障的能力。血脑屏障是维持体内稳态的重要结构，具有高度选择性，几乎不透水。因此，某些小分子/药物以及几乎所有大分子都无法穿过血脑屏障，因而无法用于治疗。首次实现生物活性化合物在大脑内运输的方法是将β-半乳糖苷酶蛋白与Tat蛋白的蛋白质转导结构域（PTD）融合（图2）。随后，研究人员开展了使用偶联药物的实验，所得数据表明，细胞穿透肽（CPP）和纳米材料的结合物有望为治疗中枢神经系统相关疾病开辟新途径。然而，由于膜结构的复杂设计以及任何破坏可能带来的生理影响，每一种跨过血脑屏障的药物递送技术进步都面临诸多局限与挑战。尽管如此，细胞穿透肽正逐渐成为实现这种复杂药物递送的潜在工具。

目前已知的大多数细胞穿透肽（CPPs）均为共价或非共价的肽类递送系统。载体肽存在诸多局限性：（i）生物相容性和生物利用度不足；（ii）可能具有毒性并引发免疫原性反应；（iii）缺乏化学稳定性；（iv）可能丧失对靶部位的特异性；（v）易被内体或蛋白酶体降解。在此背景下，MPG和Pep家族的小分子细胞穿透肽已成功应用于体外和体内多种货物（如siRNA和肽类）的递送，尤其在跨越血脑屏障（BBB）输送治疗药物方面表现突出。以下列出的CPPs可作为共价与非共价策略的替代方案，用于药物跨过血脑屏障的递送。

2.1. 脂蛋白介导的新型穿梭肽
尽管已探索了大量新型穿梭肽，但要实现高效向大脑递送仍需进一步改进，研究人员仍在寻找让药物穿越血脑屏障（BBB）的完美方法。脂蛋白似乎具有作为递送系统穿越血脑屏障的重要潜力；例如，载脂蛋白B（ApoB）和载脂蛋白E（ApoE）的类似物已被发现能够渗透血脑屏障。将高亲和力脂质结合肽类似物（即Ac-mE18A-NH2、Ac-hE18A-NH2和Ac-hE(R)18A-NH2）与hApoE标记后，其内化效率显著高于对照组（Ac-R1018A-NH2），后者受体结合域中仅含有带正电荷的精氨酸（R）。在小鼠模型中，一种治疗性肽（HAYED）——即载脂蛋白E（K16APoE）的类似物，并通过16个赖氨酸（K16）残基连接至低密度脂蛋白受体相关蛋白（LDLR）——显著降低了脑坏死程度。

2.2. 天然来源的CPPs
在天然存在的细胞穿透肽（CPPs）中，病毒来源的肽段已彻底改变了血脑屏障（BBB）靶向药物递送的方式。狂犬病病毒糖蛋白（RVG-29）可特异性结合内皮细胞和神经元表面的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR），从而促进其穿越血脑屏障。α-突触核蛋白（α-Syn）基因的过度表达是帕金森病（PD）的标志，因此治疗策略通常采用将短链RVG与带负电荷的小干扰RNA（siRNA）连接，以抑制α-Syn的表达。该版本的RVG在其C端末端添加了四个额外的甘氨酸作为间隔序列，并以带正电荷的精氨酸（R）结尾（即C2-9r：H2N-CDIFTNSRGKRAGGGGrrrrrrrrr，其中r为D-精氨酸[82]）。HIV-1-TAT肽可自发地内化半导体纳米线（Si NW），而将TAT连接至SiNW表面则有助于纳米线进入小鼠海马神经元以及原代背根节（DRG）神经元。登革热病毒2型衣壳蛋白（DEN2C）也可用作跨血脑屏障的肽类载体，因其转运过程不依赖受体，且通过吸收介导的转运（AMT）方式实现稳定运输。其中一种肽是PepH3，它具有极强的穿越血脑屏障、实现高脑部渗透的潜力。该肽可通过排泄作用轻易从大脑中清除，因此是一种理想的肽类穿梭载体，可用于将物质运入和运出大脑.

其他天然肽类穿梭分子包括源自毒液的细胞穿透肽（CPPs），这些肽已被证实能够穿越血脑屏障，将药物递送至目标部位。其中一种单环内酰胺桥联的肽模拟物（MiniAp-4）是从蜂毒中的神经毒素阿帕明衍生而来，通过简化其结构，降低毒性、免疫原性和蛋白酶抗性，同时仍能高效地将药物运送到血脑屏障并进入脑实质。

纳米配体载体（NLC）是一种脑特异性噬菌体来源的肽，可通过转铁蛋白受体靶向脑内皮细胞。一些噬菌体肽能够识别并结合其靶标，穿越血脑屏障（BBB），到达神经元和小胶质细胞。NLC-β-分泌酶1（BACE1）是另一种噬菌体展示的自组装肽siRNA复合物，在脑内可有效抑制BACE1表达，且不引起炎症或毒性反应。因此，为克服特异性和疗效方面的局限性，NLC可作为安全的多功能细胞穿透肽（CPP）或噬菌体展示肽纳米载体发挥作用。通过利用AS1411适配体与噬菌体展示的TGN肽，构建了一种脑胶质瘤级联递送系统（AsTNP）。负载多西他赛的AsTNP能轻松穿越血脑屏障，并表现出抗胶质瘤效应，显著延长了胶质瘤的生存期。此外，两种筛选出的噬菌体展示肽GLHTSATNLYLH和VAARTGEIYVPW在与原代大鼠内皮细胞及原代大鼠胶质细胞（星形胶质细胞和小胶质细胞）共培养时，可通过主动转运机制穿越血脑屏障。

2.3. CPP介导的纳米载体

肽模拟抗体/配体可通过与纳米载体偶联，识别血脑屏障（BBB）膜表面的跨细胞转运受体，从而实现高效递送。将药物或诊断剂偶联至纳米颗粒（NPs），可使其被包裹、吸附，并在特定靶部位或器官（包括大脑）释放。带有TAT肽标记的生物活性聚合物纳米颗粒（Tat-PEG-b-chol）能够成功将药物递送穿过血脑屏障。此外，经聚胺（尸胺）修饰的抗淀粉样蛋白抗体F(ab′)片段与壳聚糖纳米颗粒结合后，也可被递送至大脑。由多糖、蛋白质、氨基酸和聚酯构成的聚合物纳米颗粒（PMNPs）是目前研究最广泛的脑部药物递送系统。PMNPs可通过破坏脑毛细血管中的紧密连接（TJs）和黏附作用，或通过脑内皮细胞的跨细胞转运穿越血脑屏障。聚乙二醇（PEG）脂质体常用于与转铁蛋白（Tf）及聚-L-精氨酸（细胞穿透肽）偶联，以递送脑部成像药物和DNA。特异性于转铁蛋白受体的肽B6和表皮生长因子受体（EGFR）的GE11肽可将siRNA转运穿过血脑屏障。7个氨基酸的糖肽（g7）被用于递送响应性血管肽-2修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）杂化纳米颗粒，而甲氧基聚乙二醇（MPEG）以及甲氧基聚乙二醇-b-聚己内酯（PCL）纳米颗粒偶联血管肽-2后可在脑部富集。经K16ApoE修饰的PLGA纳米颗粒表现出更高的脑部摄取率，并为诊断目的提供了更佳的MRI对比效果。

2.4. CPP功能化金属纳米肽（NPs）

金属纳米颗粒是另一种广泛用于改善成像的纳米载体，因其能有效穿越血脑屏障。此外，谷胱甘肽（GSH）偶联的铁纳米颗粒（GSHIONPs）形成的IONPs@Asp-PTX-PEG-GSH具有稳定性好、无毒且可提高脑部MRI对比度的特点。与普通纳米颗粒相比，马来酸酐包被的超顺磁性氧化铁纳米颗粒（Mal-SPIONs）在向丘脑、颞叶和额叶皮层的分布方面表现出更优效果。将金纳米颗粒与TAT（AuNPs-TAT）或胶质瘤特异性肽氯毒素（CTX）（Au PENPs）偶联后，可在脑内实现更高的细胞摄取率。硅纳米颗粒（pSiNPs）通过携带siRNA跨越血脑屏障，利用狂犬病毒模拟的二氧化硅包被金纳米棒治疗脑胶质瘤。

2.5. CPP功能化外泌体

外泌体由树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞自然产生，其表面具有特征性的脂质层，含有多种黏附蛋白，可使其与细胞膜良好相互作用而不被单核吞噬细胞捕获。因此，这些外泌体已被用于增强药物向靶细胞（包括脑部）的递送。研究人员利用源自树突状细胞的外泌体，将神经元特异性RVG肽与溶酶体相关膜蛋白2b（Lamp2b）标记结合，以携带siRNA进入小鼠大脑。结果显示，与siRNA-RVG-9R相比，血清中白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α、干扰素γ诱导蛋白（IP）-10以及干扰素（IFN）-α的水平显著升高。此外，使用含干扰素-γ的树突状细胞来源外泌体递送miR-219，可促进大鼠大脑中的髓鞘化。通过将姜黄素负载于外泌体上，可提高其生物利用度，并将其作为药物联合环肽（c(RGDyK)）治疗脑损伤，或通过与神经肽-1靶向肽偶联用作成像材料。源自骨髓并负载siRNA和RVG（靶向配体）的外泌体成功减少了渐进性帕金森病患者脑内观察到的α-突触核蛋白积累。

2.6. CPP功能化脂质体

在过去二十年中，脂质体作为将药物递送至大脑的有效方法得到了广泛研究。脂质体纳米颗粒通常在细胞膜的磷脂双分子层内自组装，并可整合到其他生物膜中。一种含有阳离子脂质十八碳烯氧基[乙基-2-十七碳烯基-3-羟乙基]咪唑啉氯化物的阳离子脂质体-siRNA-肽（RVG-9r）通过与nAChRs肽段结合，穿透血脑屏障，将siRNA递送至FVB小鼠大脑。该脂质体含有1,2-油酰基-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）或1,2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺（DSPE），并与siRNA及RVG肽复合，靶向朊病毒蛋白。这种阳离子脂质体-siRNA-肽（RVG-9r）成功穿透血脑屏障，降低了大脑中朊病毒蛋白的表达水平。此外，镇痛肽（如kyotorphin或leu-enkephalin）自组装并被包裹于甲基 vernolate 的季铵酯衍生物囊泡中，也成功递送至小鼠大脑。修饰有RVG-9r肽的稳定核酸脂质颗粒（SNALPs）可穿越血脑屏障，并在马查多-约瑟夫病小鼠模型的大脑中递送siRNA，从而清除突变型共济失调蛋白3（SCA3）。在某些肿瘤生长过程中，将脂质体受体相关蛋白1（LRP1）与肽类药物GRN1005偶联，该药物可抑制恶性增殖。

2.7. Angiopep偶联的聚乙二醇修饰聚酰胺-胺树形大分子（PAMAM-PEG-Angiopep）

PAMAM-PEG-angiopep/DNA纳米颗粒是一种与载脂蛋白A-I（ApoA-I）和NL4肽结合的树枝状大分子纳米颗粒，已被证实可高效穿越血脑屏障。PAMAM表面含有伯氨基，能够介导含angiopep肽的纳米载体通过网格蛋白和 caveolae 依赖的内吞作用进入细胞。将负载pEGFP质粒的PAMAM-PEG-angiopep树枝状纳米颗粒通过静脉注射给予小鼠后，在PAMAM-PEG-angiopep/DNA纳米颗粒组中，可在小鼠大脑的四个区域均观察到基因表达，而作为对照的PAMAM/DNA纳米颗粒组则未见此效果。尽管阳离子型树枝状大分子表现出溶血活性和细胞毒性，但实验结果表明，短链干扰RNA（siRNA）与聚酰胺胺（PAMAM）树枝状大分子（D）复合后可实现有效的基因沉默。该复合物的沉默能力取决于树枝状大分子的代数（G4、G5、G6和G7）、离子强度以及氮磷比（N/P，即D中的氮原子数与siRNA中磷酸基团的比例）。实验发现，当N/P比为5（适用于G4、G5）或10（适用于G6、G7）时，无论离子强度如何，均可形成结构稳定的复合物，并能以较低的细胞毒性穿透脑组织。然而，即使低代数的赖氨酸树状大分子（G0和G1）与载脂蛋白E衍生肽偶联后，也能穿过血脑屏障，且未表现出显著的细胞毒性（在高达400 μM的浓度下均如此）。

基于肽的药物递送系统穿越血脑屏障（BBB）具有优缺点，例如对BBB完整性的低影响、特异性靶向以及毒性降低，但也存在与血清稳定性相关的一些问题。已发现将CPPs（细胞穿透肽）偶联至纳米颗粒、穿梭肽、脂质体、外泌体和树状大分子后，其穿越BBB的渗透性显著增强。尽管在利用CPPs穿越BBB方面已取得进展，但研究表明，在许多情况下，CPPs仅具有选择性穿越BBB的能力，这并不足以证明这些肽具备有效的BBB穿透能力。CPPs表现出的差异性内流特性可归因于其阳离子性质（是否存在精氨酸残基）、理化性质（在膜界面处的二级结构）以及生物学特性（细胞摄取能力）。靶向并穿越BBB的研究领域充满挑战却前景广阔。深入理解药物特性（药代动力学和药效学）以及BBB在分子层面的机制，对于中枢神经系统药物的设计与开发至关重要。尽管药物递送系统取得了诸多进展，但仍迫切需要研发具有更少局限性的改进型递送系统。基于肽的递送系统仍需进一步优化，并提高对脑部靶向的特异性。

3. 作为穿越血脑屏障（BBB）递送系统的归巢肽

脑肿瘤和癌症对患者往往具有致命性，因为化疗等治疗手段存在生物利用度低、血脑屏障（BBB）通透性差的问题，同时肿瘤内部异质性广泛，且缺乏特异性靶向。肽-药物偶联物（PDCs）通过化学连接子将靶向肽与治疗性有效成分连接，可模拟抗体-药物偶联物（ADC），从而拓展多种药物的治疗潜力（图3）。在穿越血脑屏障并靶向中枢神经系统疾病方面，PDCs的设计旨在劫持内源性的血脑屏障转运机制，将药物“偷运”进入脑实质。能够穿透血脑屏障的肽类或被称为“脑靶向”和“脑渗透”分子转运载体的BBB穿梭肽，是一类极具前景的分子，可突破血脑屏障并将药物递送至大脑。天然策略如噬菌体、某些病毒或天然神经趋向蛋白可通过受体介导的跨细胞转运实现穿越血脑屏障。因此，脑靶向肽、连接子以及可穿透血脑屏障的肽-药物偶联物（PDCs）通过利用内源性跨细胞转运机制，使分子得以进入大脑，从而“欺骗”了大脑。

脑靶向肽（BH）CNAFTPD 通过与肽-PEG-三乙酰基吖啶偶联物（pPAC）形成可降解的核壳型聚复合物，用于增强质粒DNA（pDNA）穿越血脑屏障（BBB）的转染效率。类似地，一种基于细菌的药物递送系统被用于胶质母细胞瘤（GBM）的光热免疫治疗。这种被称为“特洛伊细菌”的系统负载了葡萄糖聚合物和光敏性ICG硅纳米颗粒，能够绕过血脑屏障，靶向并穿透GBM组织。一种脑特异性噬菌体来源的肽（纳米配体载体，NLC）通过转铁蛋白受体和晚期糖基化终产物受体靶向脑内皮细胞。NLC-β-分泌酶1（BACE1）siRNA复合物可成功递送至神经元和小胶质细胞。因此，NLC作为安全的多功能纳米载体，其展示肽具有广泛的受体识别谱，可在无毒性和炎症反应的情况下有效克服血脑屏障。最近研究发现，CNSRLHLRC、CENWWGDVC 和 WRCVLREGPAGGCAWFNRHRL 肽可介导噬菌体在脑和肾血管中的选择性定位。这些肽序列可识别选择性的内皮标志物，用于在大脑及其他特定组织中靶向药物和基因。

在胶质母细胞瘤（GBM）这种致残性脑肿瘤疾病中，一种小分子可溶性肽（BTP-7）通过共价键连接到不溶性的抗癌药物喜树碱（CPT）上，靶向穿过血脑屏障（BBB）的人类GBM细胞外基质（ECM）。胶质瘤是另一类治疗上具有挑战性的脑癌，患者预后较差，因此需要新的药物递送策略以实现更高效的化疗手段。通过体外噬菌体展示技术，已研究了由肽段与药物组成的融合结构Dox-SMCC-gHoPe2，其中发现肿瘤归巢肽gHo是一种高效且可在体内发挥作用的载体。表1提供了作为脑部药物递送系统所使用的细胞穿透肽和归巢肽的全面总结。

参考文献：doi.org/10.3390/pharmaceutics15071999