肽的化学修饰是化学生物学中的一个新兴研究领域，能够制备出具有明确结构和改善化学性质的生物共轭物，用于生物学研究和药物开发。尽管肽已被广泛用作药物靶向递送的导向分子，但其仍存在一些不利特性：某些肽在血浆中的半衰期较短，主要原因是被蛋白酶酶解；有时肽对靶标可能表现出较低的亲和力和选择性，或因溶解度问题而难以穿过细胞膜。此外，肽的检测和纯化也受到其分子尺寸的限制。为克服这些困难，已采用多种肽修饰策略，例如引入氨基酸、脂质或连接子，进行添加、偶联或环化等操作，以提高生物利用度和药代动力学特性，这些方法已成为开展生物医学成像实验的关键手段（图1）。此外，通常在体内迅速代谢（例如在肝脏中）并经由肾脏排出的肽类物质，需要进行化学修饰，以延长其生物半衰期，并满足放射性标记肽的成像要求。

图1。 旨在改善肽类体内特性的主要化学修饰概述。

1. N端和C端修饰

针对肽的N端或C端进行修饰，是一种中和肽分子游离氨基或羧基末端正电荷或负电荷的有效策略。常用的C端和N端修饰方法包括烷基化、乙酰化、甲酰化、吡咯赖氨酸化（pGlu）以及生物素化，此外还有与尿素、氨基甲酸酯和磺胺类化合物的偶联反应。这些修饰可合成更接近天然蛋白质中性状态的分子，从而可能提高肽的生物活性。此外，N端和C端修饰通常能增强肽的稳定性，延长其保存期限，并提高其抵抗酶降解的能力。然而，末端带中性电荷的肽通常溶解度较低，因为末端的氢键被破坏；同时，这类化学修饰可能改变原始肽的构象，降低其生物活性。因此，在设计末端修饰肽时，必须充分考虑这些因素。末端修饰成功的一个例子是将其应用于亮氨酸脑啡肽（Leu-enkephalin），这是一种小分子内源性肽（Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu），可作为μ型和δ型阿片受体的激动剂，天然存在于包括人类在内的多种动物大脑中。该肽在血脑屏障和血浆中会迅速降解。因此，Bak等人提出了一种含有N端4-咪唑烷酮结构的合适前药候选物，以提高亮氨酸脑啡肽对酶的稳定性并实现其递送。

2. 非天然氨基酸（UAA）的掺入

非天然氨基酸（UAA）的引入是一种有效修饰蛋白质性质的策略，尤其有助于改善生物活性肽的药用特性。通常，UAA的引入被广泛用于增强肽对靶标分子的亲和力和选择性，并提高肽的稳定性，因为它能够诱导或稳定二级结构（如α-螺旋、β-折叠、β-转角），同时增强其对蛋白酶降解的抵抗能力。在此方面存在多种策略（图2），例如：（1）引入D-氨基酸以增强对多种降解酶的抗性：含有D-氨基酸的肽比仅含天然L-氨基酸的肽更稳定，有时还具有更高的生物活性；（2）同系氨基酸：与α-氨基酸相比，同系氨基酸多出一个CH₂或亚甲基基团（homo）。根据侧链在3-氨基烷酸骨架上的位置，可得到β2或β3同型氨基酸（侧链位于α或β碳原子上）：这种修饰可能改变其生物活性或稳定性，例如延长体内半衰期和/或增强药效，同时降低毒性。（3）N-甲基氨基酸，即氮原子上携带甲基而非质子的氨基酸：这类氨基酸通常用于提高肽类的稳定性并增强肠道渗透性。（4）α-甲基氨基酸，其中α-碳原子上的质子被甲基取代：该修饰可使肽尽可能抵抗消旋化/差向异构化，从而提高其蛋白水解稳定性。（5）其他非天然氨基酸，如瓜氨酸、羟脯氨酸、正亮氨酸、3-硝基酪氨酸、硝基精氨酸、鸟氨酸、萘基丙氨酸、亚砜蛋氨酸或磺酰蛋氨酸：这些氨基酸用于提高酶解稳定性。

图2. α-氨基酸、β2-和β3-同系氨基酸、N-甲基-α-氨基酸以及α-甲基氨基酸在(S)和(R)立体异构形式下的化学结构。

一些代表性例子包括：(i) 含有两个N-甲基氨基酸的P物质七肽类似物，这些修饰使其在人脑中几乎完全抵抗降解；(ii) 内皮素的N-甲基化类似物，其稳定性比原始形式提高了500至800倍（原半衰期约为10–20分钟）；(iii) 神经紧张素的N-甲基化，使其在血浆中的半衰期较未修饰形式有所延长；(iv) 八肽奥曲肽，在N端插入一个D-氨基酸并在C端引入氨基醇，这些修饰增强了代谢抗性，从而使该药物在人体内的半衰期增加了约1小时。

3. 肽的生物素化

肽的生物素化、亚氨基-生物素化和脱硫-生物素化是基于生物素及其类似物对链霉亲和素具有极高亲和力（KD～10⁻¹⁵ M）和特异性结合能力，从而实现肽标记、检测和纯化的高效方法。生物素化可直接作用于游离氨基末端或C端赖氨酸的ε-氨基。由于生物素-链霉亲和素系统的广泛应用，人们普遍认识到，在生物素的羧基与肽序列中的氨基酸之间需要引入长度超过4Å（约5个原子）的连接臂或间隔子，以避免空间位阻，并确保生物素能够充分接近链霉亲和素的结合口袋。此外，生物素与链霉亲和素的结合对pH和/或温度变化、有机溶剂以及变性试剂均表现出较强的稳定性。

4. 肽与载体蛋白的偶联

将肽与载体蛋白结合是一种众所周知的策略，可延长肽的半衰期，也可用于实现对特定部位的直接靶向。例如，与白蛋白结合的肽可利用人血浆中白蛋白较长的半衰期（约19天）、广泛的分布以及极低的免疫原性。相反，在动物体内注射时，将肽与载体蛋白结合通常是诱导免疫反应所必需的策略。事实上，裸露的肽抗原通常体积过小，难以有效激发产生抗肽抗体。常用的载体蛋白包括钥孔螺血蓝蛋白（KLH）和牛血清白蛋白（BSA），它们常用于弱抗原性化合物；根据肽的化学性质、载体蛋白的特性以及抗体预期用途，可利用肽上的不同功能基团（如巯基、氨基和羧基）进行偶联。

5. 脂质偶联肽

氨基酸的N端或赖氨酸、半胱氨酸的侧链可与脂肪酸（如辛酸C8、癸酸C10、月桂酸C12、肉豆蔻酸C14、棕榈酸C16或硬脂酸C18）结合。将肽类衍生为脂质可用于多种不同应用，例如：（1）通过使用长链脂肪酸延长肽在体内的半衰期；（2）增强其抗菌活性；（3）提高对真核细胞的毒性；以及（4）加快穿越细胞膜的速度。此外，还可通过在肽的N端或C端引入半胱氨酸，再与胆固醇进行偶联修饰，尤其适用于增强抗病毒肽的活性、作为高效的基因递送载体、用于抗癌药物输送，或当肽在体内半衰期较短时。

6. 环化

另一种策略是构建代表蛋白质二级结构的构型，例如形成肽环。通过环化来约束肽链是实现该策略的主要方法，这种方法在多种生物功能中起着关键作用，可提高受体选择性、活性和热稳定性，并比其线性类似物具有更强的抗蛋白水解能力。一个例子是选择性强且活性高的αvβ3、αvβ1和αvβ5整合素受体抑制剂c(RGDfV)肽，其IC50值分别为89、335和440 nM。RGD是存在于许多细胞外基质（ECM）和血清蛋白中的整合素结合最小识别序列。第4位上的D-Phe对于保持与αvβ3的结合亲和力至关重要。其类似物西仑吉肽含有甲基化的D-Phe（RGDf(NMe)V），使其在人体内比天然化合物更具活性和稳定性（半衰期约为四小时）。环化肽通常通过头尾环化或侧链-侧链环化的方式制备。最常用的肽环化方法是半胱氨酸-半胱氨酸环化和酰胺环化。前者是指在肽链中两个半胱氨酸残基的巯基侧链之间形成二硫键（S-S），例如在富含二硫键的肽（DSRs）和环肽（cyclotides）中；后者则是末端羧基与氨基之间的直接缩合反应。与二硫键相比，酰胺环化形成的化学键更为稳定。在这两种情况下，由于需要避免二聚、消旋、肽链封端以及其他可能因熵效应而被促进的副反应，合成过程极具挑战性。因此，必须在高稀释条件下，并在特定温度和催化条件下进行合成，或采用正交保护基策略，使用不同的氨基酸保护基团系列，以确保产物生成为单一且唯一的拓扑异构体。融合策略旨在通过利用小分子有机骨架、酶法或蛋白质标签等手段来应对这些挑战。例如，用于肽环化的CLIPS（化学连接肽至支架）技术是一种广泛采用的新型方法，可用于构建大规模噬菌体展示文库，生成硫醚桥联的单环、双环、三环和四环肽。

7. 连接子和间隔物的添加

连接子和间隔子是可灵活插入肽链任意位置的分子。通常，连接子主要用于提高肽的稳定性、抗蛋白酶降解性和溶解度。添加连接子还可常用于降低肽的免疫原性，并在肽与负载物之间形成一定距离。此处的负载物可以是药物、染料、标签、载体蛋白或其他感兴趣的分子，而连接子在减少结合位点空间位阻方面起着关键作用。连接子的引入通常通过标准酰胺键、硫醇-马来酰亚胺、肟键连接或点击化学反应实现，具体方法取决于肽序列及连接子的化学性质。文献中报道了多种肽偶联用连接子，包括刚性连接子，如β-丙氨酸、4-氨基丁酸、(2-氨基乙氧基)乙酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸或三氧杂十三烷琥珀酰亚胺酸，以及更柔性的连接子，如聚赖氨酸或聚乙二醇（PEG）。PEG是一类具有不同分子量的化合物，也是目前应用最广泛的连接子之一。它们具有多功能性、亲水性、非离子性和生物相容性，并已获FDA批准作为连接剂。根据长度和分子量的不同，聚乙二醇（PEG）可分为单分散型和多分散型：单分散型PEG由精确定义数量的PEG单元组成（长度少于60个原子，分子量范围为5至40 kDa）；而多分散型PEG则是不同寡聚物的混合物，具有平均长度。肽类的PEG化被广泛用于提高其溶解度并延长在体内的半衰期。事实上，PEG化过程能完全减少小肽通过肾小球滤过被清除的情况，并通过在分子周围形成保护层来防止蛋白酶降解。此外，PEG还能显著降低血清蛋白的非特异性吸附。例如，通常将PEG与纳米颗粒结合，以有效减少蛋白冠的形成，从而提升纳米系统的靶向能力，并延长其在血浆中的半衰期。另外，PEG常用于掩蔽抗原位点，降低宿主对抗原的免疫识别，进而抑制免疫反应。与PEG聚合物偶联存在两个主要缺点：一方面，偶联可能会降低肽类药物与靶标结合的亲和力和疗效，相较于原始治疗药物有所下降；另一方面，PEG化肽类无法完全生物降解，可能导致在肾脏中积累并产生毒性。

8. 金属螯合剂/放射性配体

基于放射性金属的靶向放射性药物研发是用于无创疾病检测和癌症放射治疗的一个日益重要的研究领域。用于诊断成像的放射性金属主要应用于两种核医学成像技术：单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和正电子发射断层扫描（PET）。PET扫描的图像分辨率远高于SPECT，但由于需要在回旋加速器中生产半衰期较短的PET放射性核素（如18F、11C、13N、15O），其成本也更高。相比之下，利用低能γ射线发射的放射性金属（主要是111In、90Y、99mTc、177Lu、68Ga）设计靶向肽结构的SPECT放射性药物，已成为当前成像技术和诊断中不可或缺的工具。放射性金属通常通过合适的双功能螯合剂引入肽分子中，该螯合剂的选择取决于放射性金属的氧化态，能够牢固结合金属离子，同时与生物大分子的活性基团形成动力学惰性的共轭结构。该配合物必须具有热力学稳定性，以防止放射性金属从螯合剂上解离，从而避免放射性物质在非靶器官中积累（导致非特异性信号和辐射毒性）。基于其优异的体内性能，一些双功能螯合剂（通常含有DOTA、DTPA、NOTA和TETA等大环核心结构）已被标记上放射性金属，并用于诊断成像。这些螯合剂常通过肽链的N端或C端（经由C端赖氨酸）与肽进行共价连接，从而形成热力学稳定且动力学惰性的配合物。

9. 稳定同位素标记（SIL）肽

稳定同位素标记（SIL）肽是由重同位素（2H、13C、15N）修饰的氨基酸序列组成的生物分子。由于其与未标记对照物之间存在极小的质量差异，SIL肽在蛋白质组学分析中具有极其重要的作用，尤其在极低浓度条件下表现突出，同时仍保持相同的理化性质和化学反应活性。事实上，SIL肽通常被用作液相色谱中的内标或替代标准品，用于转录组蛋白的分析，尽管SIL蛋白的制备可能受到成本和商业可获得性的限制。

10. 荧光标记肽

近年来，荧光仪器设备的进步以及新型荧光染料的合成，推动了基于荧光技术的生物分子检测取得显著进展。荧光标记的肽类在临床前研究中被广泛使用，尤其适用于体外和体内基于荧光的分析实验，如蛋白质-蛋白质相互作用分析、流式细胞术以及定位研究。例如，在小鼠初步研究中，18F标记的血管活性肠肽（VIP）类似物——一种肠道神经内分泌介质，表现出高稳定性、受体特异性和快速清除特性。荧光共振能量转移（FRET）概念的提出，特别是利用其他发色团作为荧光猝灭剂的思想，促进了淬灭型荧光肽或FRET肽的发展。基于FRET原理，可以监测“距离依赖性”相互作用：只有当距离较短（小于若干纳米）时，猝灭剂才能有效抑制荧光染料的发射。例如，Carmona 等人采用含有邻氨基苯甲酸（Abz）作为荧光基团、2,4-二硝基苯基（2,4-DNP）作为猝灭剂的FRET肽，证明供体与受体之间的“FRET肽键”水解后会产生荧光信号，从而可检测纳摩尔浓度酶的活性。最近，Bernegger 等人设计并应用了一种FRET肽，以2-氨基苯甲酰基（2-Abz）为荧光团、3-硝基酪氨酸Y(NO₂)为猝灭剂，高效开发了新型金属离子依赖性蛋白酶抑制剂，有望保护胃上皮完整性并对抗幽门螺杆菌感染。尽管该策略存在自发荧光、探测器和光学噪声以及信噪比较低等缺点，但其在连续检测荧光信号及测量分子间距离变化方面仍具有重要价值。

11. 抗体偶联

将肽与抗体或其片段（如可结晶片段Fc或抗原结合片段Fab）进行偶联，可生成智能治疗剂，有望比单一成分更具疗效且副作用更少。所得的生物分子通常兼具肽的生物学活性和抗体结构域的长半衰期。此外，由于体积较小，使用抗体片段的偶联物相比完整抗体具有更高的组织穿透能力。除了潜在的药代动力学优势外，肽-Fc/Fab融合蛋白的生产与制造也比全长单克隆抗体（mAbs）更高效、耗时更短。这类复合物作为一种有吸引力的治疗手段，在医学治疗中可提高治疗反应率并避免严重副作用。例如，J. E. Lachowicz 的团队开发了一种新型的可穿透血脑屏障的肽-单克隆抗体（mAb）偶联物，用于靶向体内人表皮生长因子受体2（HER2）阳性颅内癌细胞。该研究将抗HER2单克隆抗体（已知对乳腺癌具有强效治疗作用，但由于难以穿透大脑而对脑转移无效）与能够通过受体介导的跨细胞转运穿越血脑屏障（BBB）的Angiopep-2肽进行偶联，从而赋予其在脑内皮细胞中更高的摄取率以及更强的血脑屏障通透性。最近，美国强生生物制剂公司（Janssen Biotherapeutics）的研究人员设计了一种新型的mAb-肽偶联物，其中溴乙酰化肽被连接至单克隆抗体的半胱氨酸残基上，使其在体内对胰高血糖素和胰高血糖素样肽1受体表现出比单一组分更强的活性和亲和力。在工艺一致性和产品表征方面面临的主要挑战之一是，抗体表面通常暴露多个赖氨酸和半胱氨酸残基；因此，肽的连接通常会产生高度异质且随机的混合物，从而影响偶联抗体的疗效、安全性、药代动力学和免疫原性。为克服这一问题，一些模板导向的连接方法应运而生，通过基因工程或化学修饰手段，可对预先修饰或未修饰的单克隆抗体（mAb）进行区域选择性标记。

12. 翻译后蛋白质修饰（PTMs）

蛋白质翻译后修饰（PTMs）是指通过多种不同过程改变蛋白质的大小、电荷、结构和构象。多细胞真核生物依赖于多种翻译后修饰，这些修饰在基因表达、动植物信号转导、蛋白质区室化、隔离、降解、清除以及与其他蛋白质相互作用等众多细胞过程中发挥着关键作用，并可增强肽类物质的细胞穿透能力。最常见的翻译后修饰包括肽/蛋白质的硫酸化和磷酸化（分别在酪氨酸残基的酚侧链上共价连接硫酸基团或磷酸基团）；甲基化，即向氨基酸残基（尤其是半胱氨酸）添加甲基基团（主要用于抗氧化策略，以及通过质谱法对蛋白质进行鉴定和表征）；以及异戊二烯化，即在氨基酸的C端添加异戊二烯基团（通常为三到四个异戊二烯单元），主要作用于肽中的半胱氨酸残基。然而，关于PTMs的详细综述已在其他地方报道.

参考文献：doi.org/10.3390/pharmaceutics15061648