受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（ROR1）在多种癌症中过度表达，而在成人组织中几乎完全缺失，这使其成为肿瘤诊断和治疗的理想靶点。

为实现ROR1的无创成像，研究人员合理设计了四种基于肽的PET配体[68Ga]1−4，并评估了其在黑色素瘤成像中的应用潜力。体外实验证实了这些配体具有合理的ROR1结合亲和力（KD值分别为481.0 nM和44.9 nM），且经血清白蛋白结合基团功能化的[68Ga]2和[68Ga]3表现出特异性的细胞摄取能力。值得注意的是，对B16F10、A375和SK-MEL-28荷瘤小鼠进行的microPET/CT成像及生物分布研究表明，[68Ga]2展现出最佳的成像性能：肿瘤内蓄积率最高（达9.18% ID/g）、滞留时间持久，且非特异性背景信号相对较低。这些发现表明[68Ga]2是靶向ROR1的PET成像的理想候选探针，并凸显了基于肽的ROR1 PET探针在肿瘤成像及治疗指导方面的应用潜力。

体外稳定性

如表1所示，[68Ga]1−4在37°C条件下于生理盐水中孵育2小时后表现出高度稳定性，母体放射性配体残留率≥90%。然而，[68Ga]1−3在小鼠血浆中的稳定性较低（<90%），这很可能与线性PR3肽段被蛋白酶水解有关。与此同时，基于环状肽骨架的衍生物[68Ga]4在小鼠血浆中稳定性较差，仅保留7%的母体放射性配体。此外，测得log D7.4值范围为−2.84 ± 0.28至−0.93 ± 0.15（表1），表明这些放射性配体具有极性和亲水特性。

细胞摄取与自我阻断实验

为评估[68Ga]1−4的细胞渗透性与结合特异性，研究人员采用三种黑色素瘤细胞系（包括高转移性小鼠黑色素瘤B16F10及两种人恶性黑色素瘤细胞系A375和SK-MEL-28）进行了细胞摄取实验与自阻断实验。如图3A所示，[68Ga]1在所有三种细胞系中的细胞摄取率均较低（2小时时<4%），这与其对ROR1的弱亲和力一致。相比之下，含有血清白蛋白结合基团的[68Ga]2和[68Ga]3在B16F10细胞中表现出显著增强的摄取能力：1小时时最大摄取值达54.4%，2小时时达33.1%；而两种放射性配体在A375细胞中的摄取量可忽略不计（<0.5%），这可能反映了该细胞系中ROR1表达水平较低。在SK-MEL-28细胞中观察到显著差异：[68Ga]3的摄取率（2小时时为46.5%）显著高于[68Ga]2（<0.5%），这可能归因于其对ROR1更强的结合亲和力。[68Ga]4在B16F10细胞中的摄取呈现快速初始上升趋势（0.5小时时为10.6%），随后逐渐下降（2小时时为8.5%），这可能是由于MCP14- DOTA −ROR1复合物的稳定性低于其他示踪剂所致（Koff = 3.3 × 10⁻³ s⁻¹，见图2D）。

研究人员通过自阻断实验评估了[68Ga]1−3对ROR1的特异性结合能力（图3B）。[68Ga]1仅在SK-MEL-28细胞系中表现出显著抑制作用（p < 0.05），但细胞摄取水平较低。[68Ga]2在B16F10细胞中显示出强烈的特异性结合，在自阻断条件下抑制率达78%（p < 0.001），但在A375和SK-MEL-28细胞中的抑制率较低（分别为36%和45%）。相比之下，[68Ga]3在B16F10和SK-MEL-28细胞中均表现出显著抑制作用，抑制率分别为97%（p < 0.001）和75%（p < 0.001），而在A375细胞中抑制作用较弱（46%，p < 0.01）。

[68Ga]1在测试细胞中未能表现出足够的ROR1特异性结合能力，这与其低亲和力和细胞摄取能力一致；[68Ga]2在B16F10细胞中具有高特异性，但由于细胞摄取水平较低，在SK-MEL-28细胞中的结合能力有限；而[68Ga]3凭借其对ROR1的优异亲和力，在B16F10和SK-MEL-28细胞中均表现出强烈的特异性结合。引入C16结构单元可能进一步提高[68Ga]3的膜渗透性。

[68Ga]1−4在B16F10荷瘤小鼠体内的MicroPET/CT成像

基于良好的细胞摄取实验结果，研究人员随后在携带B16F10肿瘤的小鼠体内进行了PET成像研究，对[68Ga]1−4进行了评估。与[68Ga]1相比（图1B），[68Ga]2和[68Ga]3中血清白蛋白结合基团的引入显著增强了其肿瘤摄取能力。两种放射性配体在注射后0.5小时内均表现出快速的肿瘤摄取（图4A、C），其标准化摄取值（SUVmax）分别达到1.72和1.82，较[68Ga]1提高了约5倍。在这一初始时间点，两种制剂均显示出较高的T/M比值(6)。此外，[68Ga]2和[68Ga]3表现出更持久的肿瘤滞留效果：注射后2小时的摄取值分别为1.66和1.99，较[68Ga]1提高了约28倍，同时T/M比值始终维持在6。值得注意的是，在另一项独立的PET研究中），注射后4小时仍可观察到[68Ga]2和[68Ga]3具有较高的肿瘤放射性活性，SUVmax分别为0.99和2.77，表明其在肿瘤内的滞留时间延长。这些发现为后续开发靶向ROR1的治疗性放射性药物奠定了坚实基础。肿瘤摄取和滞留能力的提升主要归功于血清白蛋白结合基团延长的血液循环循环和改善的膜通透性，这些特性促进了放射性配体向肿瘤内的外渗。然而，PET成像还显示心脏存在显著的非特异性摄取。

特别是对于[68Ga]3而言，其心脏滞留率更高且清除速度更慢。相比之下，[68Ga]4的肿瘤摄取量可忽略不计，主要在肝脏蓄积（详见补充材料图S3），这很可能与其稳定性较差有关（表1），因此无法进一步开发为ROR1靶向PET配体。通过共注射相应的肽- DOTA 偶联物进行了自阻断实验，以评估[68Ga]2和[68Ga]3对肿瘤ROR1的结合特异性。对于[68Ga]2，与PR3-ABCF3- DOTA 共注射显著抑制了肿瘤放射性摄取（，在注射后0.5、1和2小时分别显示出25%、35%和41%的抑制率（图4B）。相反，在肌肉组织中未观察到此类抑制效应，证实了[68Ga]2在肿瘤中对ROR1具有靶点特异性结合能力。尽管[68Ga]3对ROR1具有高亲和力，但其阻断效能较低，注射后2小时仅观察到23%的抑制率（图4D）。这种减弱可能源于其与血清白蛋白的结合过强，阻碍了竞争性配体PR3-C16- DOTA 接触肿瘤ROR1位点。与[68Ga]2类似，[68Ga]3在肌肉组织中也未检测到明显抑制作用（图4D）。

[68Ga]2和[68Ga]3在B16F10荷瘤小鼠体内均表现出增强的肿瘤摄取和滞留能力；值得注意的是，[68Ga]2对肿瘤ROR1展现出更优的特异性。此外，引入血清白蛋白结合结构域（ABCF3和C16，方案1）赋予了良好的药代动力学特性，包括更高的肿瘤蓄积量和更持久的滞留时间。然而，该策略也因血液池放射性增强而提高了背景信号，从而降低了肿瘤与背景的对比度。图5展示了注射后1小时和2小时，[68Ga]2(A)和[68Ga]3(B)在B16F10荷瘤小鼠体外的生物分布情况。数据以每克组织注射剂量百分比（%ID/g）表示（胃和小肠除外，其摄取率以各器官百分比ID（%ID/器官）呈现）。

[68Ga]1−4的MicroPET/CT成像及[68Ga]2在A375荷瘤小鼠体外生物分布研究

为拓展应用范围，研究人员对携带A375肿瘤的小鼠进行了[68Ga]1−4的微正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（microPET/CT）成像研究。与B16F10细胞系不同，A375是一种高度侵袭性的人类黑色素瘤细胞系，且不产生黑色素。如图6A−C所示，所有放射性配体在注射后0.5小时内均迅速在肿瘤内聚集，其最大标准化摄取值（SUVmax）范围为0.35至1.11（详见补充材料图6C及表S4）。根据PET图像（图6A、B），[68Ga]1−4表现出显著的肿瘤-背景比值（TBR）：[68Ga]1和[68Ga]2的TBR值均高于[68Ga]3和[68Ga]4。其中，[68Ga]1在所有时间点均显示出最低的肿瘤摄取量及最快的洗脱动力学（见补充材料图6A、C及表S4），这与其在B16F10荷瘤小鼠模型中的表现一致（图1B），可能归因于其对ROR1受体的结合亲和力较低。相比之下，[68Ga]2在早期时间点（0.5小时和1小时）实现了最高的肿瘤蓄积量，其SUVmax值分别为1.11 ± 0.13和1.03 ± 0.12，但该数值仍低于其在B16F10模型中的摄取量（图4A、B）。然而，在一项自阻断研究中，PR3-ABCF3- DOTA（每只小鼠0.25毫克）的联合注射并未抑制肿瘤摄取（详见补充材料表S4），这很可能源于该细胞系中ROR1表达水平较低。相比之下，[68Ga]3和[68Ga]4表现出中等程度的肿瘤摄取，其最大摄取体积（SUVmax）值介于0.51至0.83之间，但它们在ROR1靶向PET成像中的应用潜力受限于在心脏和肝脏中的高非特异性蓄积。此外，[68Ga]2在A375荷瘤小鼠体外的生物分布结果证实了其较高的肿瘤摄取率（1小时时为9.18 ± 0.99% ID/g）和持久滞留能力（2小时时为8.79 ± 1.35% ID/g）。正如预期，血液（>25% ID/g）和肺部（>15% ID/g）均观察到较高放射性水平，与B16F10模型的结果相当，这导致PET成像背景信号增强。总体而言，[68Ga]2在A375模型中展现出最优的肿瘤摄取特性；但在当前条件下未能明确验证其对ROR1的特异性结合。这一局限可能反映了A375细胞中ROR1表达相对较低，提示阻断研究中可能需要更高剂量的竞争剂才能全面评估ROR1介导的结合效应。

[68Ga]1−3的MicroPET/CT成像及[68Ga]2在SK-MEL-28荷瘤小鼠体外生物分布研究

基于先前的研究结果，研究人员通过微正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（microPET/CT）成像及SK-MEL-28荷瘤小鼠的离体生物分布研究，对[68Ga]1−3进行了进一步评估。SK-MEL-28细胞系是一种源自人类的恶性黑色素瘤模型，常用于皮肤黑色素瘤研究。

如图7A和B所示，[68Ga]1在注射后0.5小时内即快速在肿瘤内富集，随后迅速清除，这与其在B16F10和A375模型中观察到的药代动力学特征一致。然而，在SK-MEL-28模型中的肿瘤摄取量相对较低，0.5小时时最大SUVmax为0.18 ± 0.03。类似地，[68Ga]2在肿瘤中快速蓄积，0.5小时时达到峰值SUVmax 1.11 ± 0.17，随后逐渐下降至2小时时的0.72 ± 0.15，该动力学特征与A375模型中的观测结果相符。值得注意的是，[68Ga]3表现出最高的肿瘤摄取率，其SUVmax值>1.31且随时间逐渐升高，2小时时达峰值1.51 ± 0.01。这种持续的蓄积现象与其在 SKMEL -28细胞系中的高细胞摄取能力相吻合（图3A）。然而，[68Ga]3在心脏、肺和肝脏中的非特异性摄取导致背景信号较高（见图7B及补充材料图S5），降低了整体 TBR 值；因此可能需要更长的成像时间才能获得最佳对比度。在SK-MEL-28模型中，[68Ga]2的离体生物分布研究证实了其肿瘤动力学特征：1小时时初始摄取率为2.32 ± 0.36% ID/g，至2小时时降至1.80 ± 0.27% ID/g。这些数值低于在B16F10和A375模型中观察到的结果。同时，血液（11.57 ± 2.90% ID/g）、肺部（6.02 ± 1.09% ID/g）和肾脏（4.64 ± 0.88% ID/g）中的放射性水平均有所降低（见图7D及补充材料表S2）。总体而言，这些结果表明[68Ga]2具备通过PET成像检测肿瘤ROR1的能力。此外，只要采用延迟成像时间点以消除非特异性背景信号，[68Ga]3在该应用中展现出显著潜力。

[68Ga]2是靶向ROR1的PET成像的理想候选探针，并凸显了基于肽的ROR1 PET探针在肿瘤成像及治疗指导方面的应用潜力。

参考文献：doi.org/10.1021/acs.jmedchem.6c00570