从主要的细胞外基质（ECM）蛋白中提取的各种肽序列已被开发用于涂覆或嫁接到培养皿、支架、水凝胶、植入物或纳米纤维上，以改善干细胞的黏附、增殖或分化，并培养分化细胞。
无论是否经过修饰的肽都可以通过涂层法涂覆在TCP板、聚合物薄膜、植入物或支架上。尽管在用于hPSC培养和分化的TCP培养皿上，经常通过涂层法固定诸如重组体外粘连蛋白、层粘连蛋白-511或层粘连蛋白-521等细胞外基质蛋白，但也有研究人员固定了未修饰的肽。还有一些报道指出，肽通过化学或基因工程方法与合成聚合物或蛋白质结合；所得聚合物用作涂层材料。在此主要介绍多肽类物质涂覆细胞培养材料的方法。
1. 天然线性肽作为涂层材料
短肽（少于 6 个氨基酸的序列），如 RGD、IKVAV、YIGSR、RGD、RGDS 和 RGDSP，通常难以附着在常规的二维和三维材料上，因为溶液中肽的熵值高于吸附在材料表面的肽。短肽的高熵源于其在溶液相中的高运动性。因此，大多数研究人员设计了相对较长的肽序列，包括疏水基团和芳香环以及/或带电氨基酸，以通过疏水作用和/或静电作用与材料表面结合。普等人通过将细胞外基质（ECM）蛋白中的生物活性肽位点组合起来设计肽，包括层粘连蛋白衍生肽 YIGSR 和 IKVAV。将组合肽（YIGSRWYQNMIRIKVAV、QHREDGSYIGSRIKVAV、WQPPRARIYIGSRIKVAV、DGEARGDSPKRSR）（图 1）以相对较低的组合肽溶液涂层浓度（50 毫摩尔，或 YIGSRWYQNMIRIKVAV 为 105 毫克/毫升）涂覆在多层氧化石墨烯（mGO）上。这是由于组合肽在每个组合肽上含有 3 至 4 个带正电荷的氨基酸和 0 至 3 个芳香族氨基酸，这有助于通过静电作用力和 π-π 相互作用使肽附着在氧化石墨烯表面。
图1 源自层粘连蛋白的含与不含连接段（GGGG）的组合肽序列
与天然的氧化石墨烯（mGO）表面相比，从沃顿氏胶中提取的间充质干细胞（WJ-MSCs）在肽涂层的氧化石墨烯表面上表现出更好的增殖能力和更易促成的成骨分化。这该组合肽在促进脐带间充质干细胞（WJ-MSCs）的高增殖和期望的分化方向方面是有效的。然而，将组合肽与来自单个活性位点且分子量相似的肽混合物（组合肽即由此混合物衍生而来）进行比较会更有价值（图1）。通过这样的比较，可以阐明组合肽中多个生物活性位点对WJ-MSC增殖和分化的效应。此外，肽中每个生物活性位点之间可能需要一个连接段（GG、GGG或GGGG）（图1）。例如，肽DGEAGGRGDSPGGKRSR或DGEAGGGGRGDSPGGGGKRSR可能比原始肽DGEARGDSPKRSR更有效地引导WJ-MSC的增殖和分化。
瓦伦等人对人多能干细胞（hPSCs）、人多能干细胞衍生的内胚层、中胚层和外胚层细胞以及人神经前体细胞（hNPCs）中细胞外基质（ECM）蛋白和整合素的表达进行了研究，如前所述。根据这些数据，他们设计了18种肽，这些肽源自层粘连蛋白a1（5种肽）、层粘连蛋白b1（1种肽）、层粘连蛋白g1（4种肽）、玻连蛋白（2种肽）、纤连蛋白（4种肽）和胶原蛋白（1种肽）的生物活性位点。只有四种肽包被的培养皿能够支持hNPC在培养3天后的黏附和增殖；包被在这些肽包被培养皿上的hNPC显示出与包被在层粘连蛋白上的培养皿中的hNPC相似的特征（细胞形态和细胞数量）。这四种有利的肽分别是：(a)CGGTWYKIAFQRNRK（源自层粘连蛋白a1的肽），它与整合素a6b1和a2b1结合；(b)CDIRVTLNRL（源自层粘连蛋白g1的肽），它与整合素a6b1结合；(c)CKGGPQVTR-GDVFTMP（源自玻连蛋白的肽），它与整合素avb5和a5b1结合；以及(d)CGKKQRFRHRNRKG（源自玻连蛋白的肽，HBP-1C），它与整合素avb5结合。对这四种选定的肽进行了进一步研究，以确定人神经前体细胞（hNPCs）能否在肽包被的培养皿中长期培养（最多10代）。hNPCs能够在源自纤连蛋白的肽（CGKKQRFRHRNRKG）包被的培养皿（HBP-1C包被的培养皿）中扩增，分化程度较低，形态与在层粘连蛋白包被的培养皿中培养的hNPCs相似。此外，hNPCs在HBP-1C包被的培养皿中，在神经元分化培养基中能够分化为神经元细胞。
几种神经元标志物，如β3-微管蛋白、微管相关蛋白 2（MAP2）、神经丝轻链（NF-L）和γ-氨基丁酸（GABA），在培养于 HBP-1C 涂层培养皿和层粘连蛋白涂层培养皿上的由人神经前体细胞（hNPCs）衍生的细胞中表达情况相似。因此，作者得出结论，源自玻连蛋白的肽 CGKKQRFRHRNRKG 可作为人神经前体细胞培养、增殖以及向神经元分化时的有效涂层材料。
然而，应当指出的是，他们所使用的肽（CGKKQRFRHRNRKG）涂层溶液的最低浓度为 100 毫摩尔，相当于 177.1 毫克 mL-1，而层粘连蛋白涂层溶液的浓度为 5 毫克 mL-1。这一结果表明，肽溶液的浓度应比细胞外基质蛋白溶液的浓度高 35 倍才能获得这些结果。
亨尼西等人使用 1000 毫克的肽溶液制备了涂有胶原蛋白 I 模拟肽（DGEA、P15（GTPGPQIAGQAGVV）和 GFOGER）的羟基磷灰石圆盘，以研究人骨髓干细胞（hBMSC）的附着和向成骨细胞的分化情况。与未涂覆的羟基磷灰石圆盘或涂有 GFOGER 的圆盘相比，hBMSC 在涂有 DGEA 和 P15 的羟基磷灰石圆盘上附着得更好，并且向成骨细胞的分化更有效。已知在组织特异性细胞外基质（ECM）上培养的干细胞能够高效分化为特定组织细胞。因此，Dorgau 等人通过使用表面活性剂处理，从成年牛眼的神经视网膜和视网膜色素上皮（RPE）中制备了脱细胞 ECM 肽。他们使用脱细胞 ECM 肽在分化培养基中高效地从人多能干细胞（hPSCs）生成了视杆光感受器。此外，在分化培养基中添加脱细胞 ECM 肽可增强带状突触和对光有反应的视网膜类器官的形成。尽管来自特定组织的脱细胞 ECM 肽是控制细胞分化的有前景的生物活性剂，但脱细胞 ECM 肽并非化学定义明确的物质，预计其中存在许多不同类型的肽（包括带有和不带有多种类型糖胺聚糖修饰的肽）。确定最能引导 hPSCs 分化为视杆光感受器和对光有反应的视网膜类器官的肽，对于眼病的再生治疗将具有重要价值。
2. 具有两个不同功能位点的线性修饰肽作为涂层材料
沙尔敏等人制备了源自层粘连蛋白的基因工程肽，即p20（RNIAEIIKDI）和RGD，这些肽被设计为与弹性蛋白样多肽（ELP，(APGVGV)12）结合。p20和RGD肽有助于细胞附着，而ELP则促进工程肽在细胞培养皿或支架上的锚定。在聚苯乙烯（PS）培养皿上观察到饱和的工程肽吸附，涂层浓度分别为500nM（ERE-p20肽为6.4mgmL-1，2.4mgcm-2)和E-p20肽为750nM（5.0mgmL-1，2.3mgcm-2)），这些ELP肽的涂层浓度与诸如重组纤连蛋白（5.0毫克/毫升）等细胞外基质涂层的浓度相似。在低肽溶液浓度下，含两个锚定肽ELP结构域的肽（ERE-p20）比仅含一个ELP结构域的肽（E-p20）更容易吸附并饱和于TCP培养皿上。小鼠诱导多能干细胞（miPSCs）能够附着在两种经工程改造的肽涂层表面（ERE-p20和E-p20涂层）上，其细胞结合效率与层粘连蛋白涂层培养皿相似。miPSCs被分化为神经元细胞。这些细胞依次分化为神经谱系细胞，并在涂有ERE-p20和E-p20的培养皿中培养。来自神经球的神经突在E-p20和ERE-p20涂层培养皿上比在层粘连蛋白涂层培养皿上更粗，且初级神经突和分支点的数量更多。此外，涂有E-p20和ERE-p20的培养皿上的细胞中，MAP2（一种神经元标志物）和巢蛋白（一种神经干细胞/祖细胞标志物）的表达量分别是层粘连蛋白涂层培养皿上的2.5倍和2.0倍。由层粘连蛋白衍生肽（p20）和锚定肽（ELP）组合的分子设计所制备的工程肽有助于miPSCs的高效黏附以及miPSCs向神经谱系细胞的最优分化，因此可作为涂层材料使用。
图2 源自层粘连蛋白的基因工程肽 p20（RNIAEIIKDI）和 RGD 与弹性蛋白样肽。
几位研究人员开发了类似的工程肽设计。例如，Truong 等人开发了工程肽（A99-ELP-R），它包含层粘连蛋白α1 链衍生肽（A99，AGTFALRGDNPQG）和弹性蛋白样肽（（VPGIG）30）以及 GMG 连接段（图 2）。Lee 等人将层粘连蛋白α5 的球状结构域 1 - 3 与 ELP 融合，这是一种由于分子量高（70 kDa）而应被称为蛋白质的工程肽。涂有 1 毫克/毫升这种工程肽（蛋白质）的 TCP 培养皿能够支持人骨髓间充质干细胞的黏附，并具有良好的干细胞特性。
李等人设计了一种结合了两种不同肽域的肽：一种肽是骨形态发生蛋白-2（BMP-2）域，KIPKACCVPTELSAISMLYL，另一种肽是羟基磷灰石结合域。该工程肽的灵感来源于具有α-螺旋结构的N端骨钙素，其序列形式为γ EPRRγ EVAγ EL、γ EPRRAVAAL、EPRREVAEL和EPRRAVAAL。其中 γ E是γ-羧基谷氨酸。原始的N端骨钙素域 γ EPRRγ EVCγ EL经过（i）用丙氨酸（A）代替半胱氨酸（C）和（ii）在某些肽中用谷氨酸（E）或丙氨酸（A）代替 γ E的修饰，这可能会影响与原始N端骨钙素域相比α-螺旋结构的稳定程度。四个连续的丙氨酸残基序列（AAAA）被用作两个不同肽域之间的连接段，有助于形成α-螺旋结构。在聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）薄膜上生长的羟基磷灰石层，用浓度为100毫克/毫升的肽溶液涂覆了设计的肽eBGa3（KIPASSVPTELSAISTLYL-AAA-γEPRRγEVCγEL）、eBGA1（KIPASSVPTELSAISTLYL-AAA-γEPRRAVAAL）、eBGu3（KIPASSVPTELSAISTLYL-AAA-EPRREVAEL）和eBGu1（KIPASSVPTELSAISTLYL-AAA-EPRRAVAAL）。本综述中讨论的用于涂覆或接枝细胞外基质蛋白衍生肽的基础聚合物材料的化学结构示意图见图3。
图3（a）天然聚合物（海藻酸盐、壳聚糖、羧甲基壳聚糖和透明质酸）、（b）可生物降解聚合物（聚-L-乳酸[PLLA]、聚乳酸-羟基乙酸共聚物[PLGA]和聚己内酯[PCL]）以及（c）合成聚合物（聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）[聚HEMA]、聚（N-异丙基丙烯酰胺）、聚乙二醇[PEG]、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯[PEG二甲基丙烯酸酯]、聚丙烯酸酯、聚乙烯砜-聚乙烯醇（PVA）共聚物、聚（乙烯醇-衣康酸）[PVA-IA]）的化学结构式，这些聚合物被用作涂层或接枝细胞外基质蛋白衍生肽的基础聚合材料。
肽的饱和吸附量取决于 N 端骨钙素的修饰肽。在聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）表面生长的羟基磷灰石上结合的肽量依次为：eBGa3 >eBGa1>eBGu1=eBGu1>KIPASSVPTELSAISTLYL。与肽的饱和吸附量相似，肽从在 PLGA 薄膜上形成的羟基磷灰石在水溶液中释放。肽 eBGa3 释放缓慢（70 天后仅释放 16%），而肽 eBGu1 和 eBGu3 释放速度则快得多（5 天后释放超过 93%）。这些结果表明，eBGa3 中的 γEPRRγEVAgEL 产生了最稳定的α-螺旋结构。涂有 eBGa3 的羟基磷灰石（在 PLGA 薄膜上形成）促进了人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）在成骨培养基中向成骨细胞的有效分化。在涂有 eBGa3 的羟基磷灰石（在 PLGA 薄膜上形成）上，hBMSCs 的成骨分化程度高于涂在 TCP 培养皿上或涂有其他肽的羟基磷灰石（在 PLGA 薄膜上形成）的 hBMSCs。
研究不同功能肽与关节段的组合，例如锚定肽和生物活性肽与关节段的组合，对于开发复杂的生物活性肽作为涂层材料应是有益的。
另一种由两种不同功能肽组合而成的肽设计是EEEEEEERGD，这是由Sawyer等人开发的，其中E7被设计用于通过与羟基磷灰石生物材料表面的离子相互作用来增强肽的锚定。先用低浓度的EEEEEEERGD（1–10毫克mL-1)）预涂羟基磷灰石，然后用100%FBS涂覆，与先涂RGD再涂FBS的羟基磷灰石（未进行EEEEEEERGD预处理）相比，促进了hBMSC的黏附和铺展。与在EEEEEEERGD涂覆的羟基磷灰石上培养相比，在涂层肽中引入如GGGG这样的连接段（形成EEEEEEE-GGGG-RGD涂覆的羟基磷灰石）可能会改善hBMSC的黏附、铺展和分化特性。
3 环肽作为涂层材料
一些研究人员已将不会与蛋白质结合的环肽用作涂层材料，以增强干细胞、祖细胞和原代组织细胞的附着、铺展和分化。
索耶等人使用两种肽涂层来改善人骨髓间充质干细胞（hBMSC）在羟基磷灰石上的附着和铺展，以促进骨再生。这些肽涂层包含非天然氨基酸：一种是线性肽GRGDdSP（其中使用了D-丝氨酸（dS）），另一种是环肽G(Pen)GRGDSPCA，其中(Pen)表示青霉胺；青霉胺中的一个巯基与丝氨酸中的一个巯基结合，从而在G(Pen)GRGDSPCA肽中形成环肽（图4），仅在羟基磷灰石表面单独涂覆GRGDdSP或G(Pen)GRGDSPCA并不足以促进细胞附着和铺展。当表面先用低浓度的肽（如1或10毫克/毫升）预涂覆，然后用100%胎牛血清（FBS）涂覆时，hBMSC在羟基磷灰石上广泛附着和铺展。有趣的是，高浓度的肽预涂覆（100或1000毫克/毫升）并不能促进细胞附着和铺展。在用肽/FBS涂层制备的羟基磷灰石表面，细胞附着受到抑制。这一发现可以解释为：GRGDdSP与纤连蛋白的结合位点（整合素受体）结合，而G(Pen)GRGDSPCA与玻连蛋白的结合位点结合。
图4 环肽 G(Pen)GRGDSPCA 的化学结构
表面单个肽的浓度过高会抑制细胞外基质蛋白和其他结合位点的糖胺聚糖的使用，或者在培养基中产生游离肽。这些游离肽从羟基磷灰石表面释放出来，作为抑制细胞在羟基磷灰石表面结合的抑制剂。这可能是使用GRGDdSP而非GRGDSP（所有氨基酸均为L-异构体）的原因，以减少游离肽对人骨髓间充质干细胞的结合，从而降低其抑制作用。何等人还报道，用LL-37肽（LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES）涂覆的钛（Ti）植入物，这种阳离子抗菌肽，中等浓度（50毫克/毫升）或低浓度（5毫克/毫升）的肽促进了大鼠骨髓间充质干细胞的扩增和存活，而高浓度（100毫克/毫升）则不然。因此，生物活性肽在细胞培养材料上的共价结合对于防止其释放并起到抑制作用十分重要（图5）。
图5材料（a）涂覆或（b）接枝有细胞外基质（ECM）蛋白或其衍生肽时的细胞附着倾向。（a）随着ECM蛋白或其衍生肽涂覆浓度的增加，细胞附着量达到最大值。（b）随着ECM蛋白或其衍生肽涂覆浓度的增加，细胞附着量趋于平稳。
GRGDdSP和G(Pen)GRGDSPCA肽在人骨髓间充质干细胞（hBMSC）的附着和铺展方面没有显著差异。如果使用人多能干细胞（hPSC）代替人骨髓间充质干细胞，不同肽涂层对hPSC附着和增殖的影响可能会更加明显，尤其是单肽涂层表面与混合肽涂层表面的对比，这将有助于更好地评估这些肽。
4 化学改性肽作为涂层材料
在一些先前的研究中，设计了几种来自细胞外基质（ECM）蛋白的化学修饰肽序列，并将其接枝到聚合物或生物大分子上作为涂层材料。然后将干细胞培养在涂有肽结合物的表面上。
图6 聚酰胺胺 RGD 肽偶联树形分子的制备及化学方案
维达等人制备了聚酰胺胺RGD肽偶联的树状大分子（图6），将其涂覆在聚苯乙烯培养皿上用于人骨髓间充质干细胞（hBMSC）培养；研究中使用了（RGDC）8-聚酰胺胺树状大分子和聚酰胺胺树状大分子-（CRGD）8。涂覆（RGDC）8-聚酰胺胺树状大分子的培养皿上培养的hBMSCs比涂覆聚酰胺胺树状大分子-（CRGD）8的培养皿上培养的细胞贴壁更好，增殖更旺盛。如果在RGD肽和聚酰胺胺之间引入GG、GGG或GGGG连接段，并且选择RGDSP而不是RGD作为生物活性肽（例如（RGDSP-GGGG-C）8-聚酰胺胺树状大分子），细胞的黏附和分化可能会比研究中观察到的情况有所改善。
杨等人设计了一种可点击的仿贻贝肽（3,4-二羟基-L-苯丙氨酸-聚乙二醇-叠氮化物（（DOPA）4-PEG5-叠氮化物）），利用聚多巴胺，将可点击的仿贻贝肽共价连接到钛氧化物（TiO2）涂层不锈钢支架表面的羟基上，采用仿贻贝粘附（图7）。随后，通过生物正交偶联，将一氧化氮生成有机硒（二苯基环辛炔（DBCO）-硒代半胱氨酸）和二苯基环辛炔（DBCO）连接的内皮祖细胞（EPC）结合肽（TPSLEQRTVYAL）（TPS-DBCO，二苯基环辛炔封端的EPC结合肽）点击到与可点击仿贻贝肽共价连接的TiO2涂层支架表面（图7）。这种工程化的支架表面具有出色的抗血栓形成能力，这可能是由于一氧化氮生成有机硒位点的作用，同时对EPC的募集和增殖有显著促进作用，这可能是由于工程化支架表面的EPC结合肽所致。这些结果很有趣；然而，制备（DOPA）4-PEG5-叠氮化物、二苯基环辛炔（DBCO）-硒代半胱氨酸和TPS-DBCO并将该设计应用于其他生物材料需要一定的有机合成技能。
图7利用贻贝启发的黏附性将可点击的贻贝启发肽共价接枝到钛氧化物涂层的不锈钢支架表面。（A）可点击贻贝启发肽（（DOPA）4-PEG5-叠氮化物）、产生一氧化氮的有机硒（（DBCO）-SeCA）和RPC结合肽（TPS-DBCO）的化学结构式。（B）通过贻贝启发的配位相互作用和生物正交点击化学在代表性血管支架表面进行共接枝。
塔特拉伊等人合成了聚[Lys-(Ser0.9-DL-Ala2.7)]的支链聚合物，并在其上接枝了环状RGD（图8），这种聚合物可以涂覆在用于外科植入物和天然骨替代品的TCP培养皿和钛合金上，这种骨替代品在牙科诊所中被称为“Bio-Oss”。人脂肪源性干细胞能够有效地附着在环状肽接枝聚合物涂覆的表面上，并在分化培养基中广泛分化为成骨细胞。为了全面评估环状RGD的效果，应合成不仅接枝环状RGD（环（RGDfC））肽，还接枝线性RGD肽（如RGD、RGDS和RGDSP）的支链聚合物。然而，使用含有环状RGD肽的涂层肽材料有望增强干细胞的附着、增殖和分化。
图8 带有环状 RGD 的聚[Lys(Ser0.9-DL-Ala2.7)] 分支聚合物的示意图。
5 作为涂层材料的与蛋白质结合的基因工程或化学工程改造的肽。
肽通过基因或化学方法与蛋白质结合，肽结合蛋白质可用作涂层材料。
林等制备了肽偶联牛血清白蛋白（BSA）作为涂层材料，其中肽源自层粘连蛋白-111序列（AG73、RKRLQVQLSIRT；C16、KAFDITYVRLKF；A99、AGTFALRGDNPQG；AG10、NRWHSIYITRFG；EF1XmR、RLQLQEGRLHFXFD，其中X=Nle），并采用硫醇-马来酰亚胺点击反应将肽与BSA偶联（该反应在下文有更详细的讨论）。89在涂有AG73或C16肽偶联BSA的TCP培养皿上，神经祖细胞干细胞（NPSCs）能够高效分化为神经元和星形胶质细胞。特别是涂有C16肽偶联BSA的TCP培养皿促进了神经元标志物（如突触融合蛋白1A和突触小泡相关蛋白25）的表达。
6. 聚多巴胺作为肽类固定化涂层载体
贻贝分泌的贻贝足蛋白5是一种含有3,4-二羟基-L-苯丙氨酸（多巴胺的前体）的粘附垫，能在大多数材料表面，包括金属和有机或无机材料表面，提供强大的粘附力。受贻贝启发，一些研究人员使用聚多巴胺对材料表面进行涂层处理。聚多巴胺涂层表面能够吸附生物活性肽和羧甲基壳聚糖等功能性聚合物，这些聚合物可以通过化学反应与生物活性肽结合。当肽中含半胱氨酸时，半胱氨酸的巯基可以与聚多巴胺的儿茶酚基团结合（迈克尔加成）。此外，肽中含有的e-胺，如赖氨酸侧链，其胺基也可以与聚多巴胺的儿茶酚基团结合。
参考文献：DOI: 10.1039/d2tb02601e
