线粒体是真核细胞内关键过程中的重要细胞器，其功能障碍与包括神经退行性疾病和癌症在内的多种疾病有关。因此，从基础科学研究到临床医学，对线粒体功能进行药物干预都至关重要。然而，与其他细胞器相比，线粒体因其疏水且致密的双层膜系统以及负膜电位而难以接近。
为了应对将生物活性物质精准递送至这些重要亚细胞区室的挑战，人们投入了大量精力来开发能够将生物活性货物运输到线粒体内部的线粒体靶向系统。目前存在利用小分子、肽、脂质体和纳米颗粒进行运输的系统。现有的载体在大小和结构上各不相同，能够促进多种化合物向线粒体内部的递送。值得注意的是，基于肽的递送支架具有合成简便、可调性好、生物相容性佳以及在细胞内和体内均具有高摄取率等优点。由于其合成简单且模块化，这些肽能够高度适应化学性质多样的货物递送。线粒体靶向肽的关键设计特征包括阳离子电荷，这使它们能够利用线粒体的负膜电位，以及亲脂性，这使得它们能够与线粒体的疏水膜发生有利的相互作用。这些肽已被共价连接到靶向治疗剂上，包括抗癌药物，以增强其药物特性，并为线粒体生物学提供探针。有趣的是，针对线粒体的DNA损伤剂显示出高效力，并且能够避开耐药机制和脱靶效应。此外，将针对线粒体的DNA损伤剂组合应用于siRNA筛选，以阐明尚不为人所知的线粒体DNA修复和复制途径。在这项工作中，发现了多种对维持线粒体核酸至关重要的新型蛋白质。针对线粒体的肽也已被用于扩大具有显著哺乳动物毒性的抗菌药物的治疗窗口。鉴于线粒体和细菌在进化上的相似性，肽是能够同时靶向这两种实体的有效转运体。这些抗菌肽即使对于难以靶向的位于宿主细胞内的细菌也具有很高的效力。
这种基于肽的靶向线粒体的方法为线粒体的“可成药性”以及可能成为未来药物靶点的新生物过程提供了多种见解。然而，线粒体靶向领域仍处于起步阶段，许多针对细胞器特异性缀合物的令人兴奋的应用仍有待探索。在这篇综述中，我们重点介绍了我们实验室开发的线粒体穿透肽的发展和优化，线粒体靶向生物活性货物的独特应用，并对该领域的重要发展方向提出了展望。
线粒体穿透肽的开发
设计用于线粒体靶向的分子递送载体必须考虑到线粒体的独特特征。尽管线粒体外膜（OMM）具有通透性，但线粒体内膜（IMM）却高度致密，并富含诸如心磷脂之类的疏水性磷脂分子，这对亲水性分子的摄取构成了巨大障碍。此外，由于电子传递链（ETC）的存在，IMM两侧存在很强的负电位差。为了促进分子穿过这些膜进入基质，线粒体含有诸如TIM/TOM复合物之类的转运通道，该复合物介导蛋白质转运，以及多种专门用于小有机阳离子的转运蛋白。一些针对线粒体的策略利用了这些特定的转运蛋白。然而，最近的研究更多地集中在设计能够直接穿越IMM的动态分子上，从而能够可靠地将各种化学物质递送至该细胞器。
在开发线粒体靶向分子（即能在细胞内或体外系统中积聚在线粒体内的分子）时，有一些重要的生物物理参数需要考虑。具体而言，亲脂性（logP，辛醇-水分配系数的对数）和分子的电荷（Z）是重要的物理化学性质，它们会影响线粒体的积聚。通常，亲脂性高、带正电荷（Z>0）且logP值大于-1.7的分子显示出显著的线粒体摄取。分散的亲脂性阳离子（DLC）是这类线粒体靶向分子的主要类别。将正电荷分散在较大的分子表面积上，可降低化合物在通过内膜之前脱溶所需的活化能。因此，运输的活化能可以看作是两种力的平衡：Born能量和疏水能（图1A）。Born能量代表将阳离子移入膜所需的能量，而疏水能则定义为将相同大小和疏水性的中性分子移入磷脂膜所需的能量。能斯特方程还表明，通过利用存在于细胞质基质和线粒体内膜之间的电化学梯度（分别为-60毫伏和-180毫伏），二价阴离子（DLCs）能够在线粒体中积累10000倍。
图1.控制线粒体定位的结构和能量因素。（A）亲脂性阳离子化合物摄取的支配关系。（1）Born能量（千焦/摩尔），其中r=半径，Z=电荷。（2）Nernst方程（毫伏）。（B）表现出线粒体定位的结构支架。（1）用胍基团修饰的山梨醇支架；（2）由手性双环胍基残基组成的低聚物；（3）三苯基磷（TPP）阳离子；（4）精氨酸残基；（5）二甲苯胺阳离子。所有R基团代表可能与货物连接的点。
观察到的DLCs中高水平的线粒体积累启发了开发具有类似特性的其他线粒体靶向剂（图1B）。精氨酸中的胍基部分可用作模块化基团，将离域阳离子整合到各种化合物中以实现线粒体靶向。其他靶向基团包括由手性双环胍基残基组成的寡聚物、用胍基部分修饰的山梨醇支架、三苯基磷离子（TPPs）、八精氨酸寡聚物、二甲苯四氮离子、SS肽以及两亲性和阳离子β-折叠肽。其中一些线粒体靶向基团可以整合到较大的脂质体和纳米颗粒中，用于递送高分子量大分子，如核酸。每种递送剂都面临一组独特的限制，这可能会限制它们能够靶向的分子或缺乏进入特定线粒体区室的能力。因此，需要开发一种通用的递送系统，能够进行修改以适应货物的化学性质，从而实现特定的线粒体摄取。
我们设计的线粒体穿透肽（MPPs）正是基于这一目标，因此我们致力于合成并改造这些载体，以实现结构各异分子的递送。MPPs的设计基于已知的细胞穿透肽（CPPs）家族的信息，这些肽具有亲水性和阳离子特性（图2A）。通过在CPPs中引入高度疏水性残基，构建了一个具有不同线粒体定位特性的MPPs库（见表1和图2B）。重要的是，合成的所有肽都保持了高水平的细胞摄取，但它们的线粒体定位效率却大不相同。含环己基丙氨酸的MPPs显示出最高的线粒体定位水平。这一肽家族的研究结果表明，分子化学结构的细微变化会显著改变其在线粒体中的定位，这很可能是由于log P值的变化所致。总体而言，带3+电荷且log P值高于-1.7的MPPs能够在细胞内积累于线粒体。
图2.穿线粒体肽及其缀合物的发展。（A）细胞穿膜肽（CPPs）的序列优化以获得高度线粒体特异性的穿线粒体肽（MPPs）。用于递送的优化MPP（Fxr）3的化学结构显示在右侧。非天然氨基酸的缩写分别为Fx、hex和r，分别代表环己基丙氨酸、己基和d-精氨酸。OMM，外线粒体膜；IMS，膜间隙；IMM，内线粒体膜。（B）表1中列出的一组MPP的线粒体定位。Rr值代表MitoTracker（线粒体特异性染料，红色通道）与荧光标记肽（绿色通道）之间的皮尔逊相关系数。（C）定位在线粒体基质中的MPP的透射电镜图像。
在最初开发MPPs之后进行的研究调查了用于最大化线粒体定位的逻辑是否可以通过破坏线粒体来产生对癌细胞的毒性。有趣的是，发现放置阳离子电荷而不插入疏水性残基会损害肽的线粒体定位。实际上，以块状结构合成的肽比具有交替疏水性和阳离子残基的肽表现出更高的亲脂性。通过交替排列精氨酸和亲脂性残基制备的MPPs，总电荷为4+，logP值在-0.5至+1.4之间，显示出最佳的线粒体定位。进一步评估了MPPs，以确定肽链长度、电荷和疏水性对线粒体破坏能力的影响。总体而言，肽链长度和电荷的增加（从+3到+6）以及高疏水性增强了线粒体破坏活性。这种策略被应用于文献中报道通过膜破坏起作用的抗癌肽（KLAKLAK）2。只需将亮氨酸替换为更疏水的氨基酸，如环己基丙氨酸、苯丙氨酸和己基残基，就能增强线粒体破坏活性和抗癌肽的效力。这些研究使得用于直接抗癌活性或用于生物活性化合物线粒体递送的MPPs的长度、电荷、疏水性和二级结构得以优化。
上述许多线粒体靶向肽在OMM（外膜）、IMS（膜间隙）或IMM（内膜）中积累，这阻碍了它们与线粒体基质内各种药理学上有趣的因子相互作用。重要的是，定位研究显示MPP能够定位于基质内。细胞膜去极化或线粒体膜电位的扰动显著降低了MPP的摄取，表明MPP通过膜的转运是电位依赖性的。斯彭斯及其同事发现，局部MPP浓度的增加会通过固态核磁共振将肽重新分布到外膜和内膜的双层中。随后，基质中强烈的净负电荷促进了阳离子MPP跨IMM直接进入基质的移动，这一点已通过透射电子显微镜进一步证实（图2C）。与MPP不同，SS肽定位于IMM内，其摄取几乎不受膜电位的影响。最后，要将这些肽应用于生物和治疗用途，肽具有高生物相容性至关重要。近期的研究表明，微粒在体外和体内模型中均具有低毒性，这使它们成为靶向生物活性化合物的理想载体。
用抗癌药物靶向线粒体基因组
DNA损伤型抗癌药物是一类很有意思的分子，可将其递送至线粒体，因为这些分子与核DNA（nDNA）的相互作用比与线粒体DNA（mtDNA）的相互作用要清楚得多（图3A）。用DNA损伤剂靶向线粒体DNA相比于靶向核基因组可能具有诸多优势。例如，线粒体缺乏许多存在于细胞核中的DNA修复途径。此外，损伤线粒体基因组可能会给细胞带来严重后果。与nDNA不同，mtDNA缺乏内含子，并且富含表达电子传递链（ETC）蛋白质亚基及其翻译机制所必需的基因。因此，线粒体基因组中的任何突变都可能对这些基因产物的结构和功能产生不利影响。总体而言，线粒体DNA可能比核基因组更容易受到DNA损伤，这可能会增强抗癌药物的效力。如果未修复，线粒体DNA突变的积累可能会特别有害，因为功能失调的氧化磷酸化会导致活性氧（ROS）的产生，从而触发内在凋亡途径并最终导致细胞死亡。
图3.与线粒体穿透肽结合的药物偶联物及其活性谱。（A）与MPPs偶联的治疗剂和探针。（1）噻唑橙，（2）氮芥及其衍生物，R1=H、OH和R2=H、NO2，（3）阿霉素，（4）基于顺铂的铂类药物，（5）甲氨蝶呤。所有R基团均代表MPPs。（B）线粒体靶向氮芥（mt-Cbl）的效力比母体化合物氮芥（Cbl）和未修饰的MPP高30倍以上。（C）通过结构修饰降低mt-Cbl的烷化活性会导致细胞死亡机制从坏死转变为凋亡。
我们最初使用一种强效抗癌药物——氮芥来探究特异性破坏线粒体基因组的效果。当这种药物与DNA发生反应时，会产生双功能的链间和链内DNA交联。有趣的是，线粒体靶向氮芥（mt-Cbl）的效力比基础药物提高了30多倍（图3B）。令人惊讶的是，进一步的研究表明，线粒体靶向还会改变这种化合物的细胞毒性作用机制。尽管用mt-Cbl处理细胞时检测到了一些线粒体DNA（mtDNA）损伤，但当将野生型143B细胞与缺乏mtDNA的143Bρ°细胞进行比较时，细胞活力未受影响。这导致了一个假设，即除了DNA之外，其他大分子可能是潜在的靶点。确实观察到了几种烷基化的线粒体蛋白加合物，这表明交联蛋白质在启动细胞死亡方面具有重要意义。另一个令人惊讶的发现是，当这种高反应性化合物被靶向线粒体时，细胞死亡机制似乎从细胞凋亡转变为细胞坏死。后者已被报道会在生物体中引发诸如炎症反应和严重组织损伤等使人衰弱的副作用。为了应对这种原本有效的线粒体靶向抗癌药物的这一方面，通过合理设计的结构改造降低了mt-Cbl的反应性（图3C）。这一策略成功地将细胞死亡机制逆转为细胞凋亡。重要的是，这些改造并未影响mt-Cbl避免耐药机制的能力。
线粒体靶向 DNA 损伤剂可规避耐药机制和脱靶效应
DNA损伤型抗癌药物在临床上常常因耐药性的产生而失效（图4A）。我们假设将药物重新定向至线粒体能够通过规避耐药性的分子机制来恢复药物疗效。事实上，我们能够证明，mt-Cbl能够有效杀死对氯氨芥母体化合物具有耐药性的白血病细胞。此外，当用过表达药物失活酶或外排泵的癌细胞系进行挑战时，mt-Cbl的活性几乎不受影响。将氯氨芥隔离在线粒体中，使其免受存在于该细胞器之外且在许多癌细胞类型中过表达的耐药因子的影响。同样，将广泛使用的诱导双链DNA断裂的抗癌药物阿霉素靶向线粒体，也被证明能够对抗因外排泵过表达而产生的耐药性（图4B）。
图4.靶向线粒体的DNA损伤剂可规避耐药机制和脱靶效应。（A）规避肿瘤细胞耐药途径。未靶向的DNA损伤剂可通过（1）外排泵从细胞中排出，（2）被谷胱甘肽S转移酶（GSTs）解毒，或（3）通过上调的DNA修复途径从基因组DNA中移除。将这些药物靶向线粒体可绕过这些途径并恢复活性。（B）线粒体靶向阿霉素（mtDox）可规避Pgp介导的耐药性。耐药因子=耐药细胞的半数致死浓度（LC50）/敏感细胞的半数致死浓度（LC50）。CsA：环孢素A，一种Pgp抑制剂。（C）线粒体靶向铂化合物（mtPt）的效力不受细胞核中核苷酸切除修复（NER）蛋白过表达的影响。（D）mtDox随时间推移在A2780卵巢癌细胞中诱导累积的线粒体DNA（mtDNA）损伤，但在H9c2大鼠心肌细胞中则不会，而阿霉素（Dox）处理则会对这两种细胞系均造成损伤。相对PCR扩增以未处理的细胞为基准进行了标准化处理，并且与诱导的线粒体DNA损伤呈负相关。(E)代表性的体内生物发光图像，显示了多柔比星耐药性骨肉瘤异种移植小鼠。
还开发出了几种针对线粒体的铂类抗癌药物顺铂的靶向版本。顺铂的细胞毒性是由其介导的DNA链内交联引起的，这些交联是核苷酸切除修复（NER）途径的有效底物。因此，癌细胞常常通过上调NER蛋白的表达和活性来对顺铂产生耐药性。然而，线粒体不具备核苷酸切除修复活性。因此，将顺铂与MPP共轭（mtPt）的类似物能够有效杀死过表达NER蛋白的耐药癌细胞系（图4C）。另一项研究表明，通过将顺铂封装在聚合物纳米颗粒递送系统中，可以将其靶向线粒体，并且也显示出类似的克服肿瘤细胞耐药性的能力。
线粒体靶向的另一个有趣应用是减轻脱靶毒性。例如，阿霉素的治疗效用受限于其对心肌细胞的高特异性毒性，这常常导致患者出现剂量限制性的心脏毒性。我们能够证明，线粒体靶向阿霉素（mtDox）对心肌细胞的毒性显著降低，同时仍保持高水平的抗癌活性（图4D）。进一步的研究表明，阿霉素在细胞线粒体中的隔离会产生对癌细胞有毒性的线粒体DNA损伤，同时避免了导致心脏毒性的核DNA损伤信号通路的激活。最近的一项研究显示，在阿霉素耐药的骨肉瘤异种移植小鼠模型中，线粒体DNA大幅减少了肿瘤体积，同时未表现出心脏毒性的迹象（图4E）。
利用细胞器特异性化学探针探究线粒体 DNA 修复与复制途径
线粒体靶向DNA损伤剂不仅是有趣的候选药物，还被用作研究线粒体生物学的工具。最近，我们证明线粒体靶向DNA损伤剂可用于高通量siRNA筛选，以鉴定新的线粒体DNA修复因子（图5A）。我们假设由于许多在线粒体中起作用的DNA维护因子是已知在细胞核中修复DNA的蛋白质，通过筛选已知的核修复和维护因子的siRNA文库，我们可能会发现新的线粒体DNA修复蛋白。通过降低单个修复基因的表达，并监测基因敲低与线粒体DNA损伤剂毒性之间的协同作用，确定了可能在线粒体DNA修复中起作用的基因（图5B）。这项研究确定了22种此前未注释有线粒体功能的蛋白质，它们与线粒体DNA损伤探针表现出协同毒性。在进一步研究的蛋白质中，有核内NER蛋白RAD23A，它似乎在一种新的氧化型线粒体DNA损伤修复途径中发挥作用，还有双链DNA断裂修复蛋白XRCC4，它在线粒体DNA链断裂的连接中具有新的作用。最重要的是，这项研究揭示了一种新的线粒体DNA聚合酶（DNA聚合酶θ），它似乎在线粒体DNA复制中起着关键作用（图5C）。敲除DNA聚合酶θ基因的细胞与野生型细胞相比，基础耗氧量降低，这是由于线粒体DNA修复和复制受损所致（图5D）。有趣的是，敲除细胞的线粒体DNA突变率也低于野生型细胞，这表明DNA聚合酶θ可能在错误倾向性DNA合成和修复中发挥作用（图5E）。这类研究利用线粒体靶向生物活性剂更好地对线粒体蛋白质组进行功能表征，代表了线粒体化学生物学的一个新且令人兴奋的方向。
图5.利用靶向探针鉴定的线粒体DNA修复和复制蛋白。（A）通过分析siRNA敲低DNA修复基因与线粒体DNA损伤剂活性之间的协同效应，能够识别出参与线粒体DNA修复的基因。（1）DNA修复因子的表达和（2）蛋白质向线粒体的导入。（B）从筛选中获得的前40个命中结果，按z分数排序，其中更负的z分数表明在用线粒体靶向噻唑橙（DNA氧化剂）处理时，给定蛋白质的mRNA被敲低后细胞活力的损失更大。敲低还增加了mtDox（dsDNA诱导剂，蓝色）或mtCbl（非特异性线粒体损伤诱导剂，红色）的毒性。（C）DNA聚合酶θ（绿色）在细胞中与线粒体（红色）共定位。（D）POLQ基因敲除（KO）细胞的基础耗氧量低于野生型（WT）细胞。（E）POLQ基因敲除细胞的线粒体DNA突变率低于野生型细胞。
利用线粒体靶向肽扩大抗菌药物的治疗窗口
有趣的是，线粒体的许多物理化学性质与细菌相同，导致许多线粒体靶向药物也会在细菌中积累。我们利用这种交叉靶向性开发了抗菌肽偶联物来靶向细菌（图 6A）
甲氨蝶呤（Mtx）是一种抗叶酸药物，通常因其对生长中的哺乳动物细胞具有毒性而被用作化疗药物和引产药。甲氨蝶呤还能通过抑制细菌二氢叶酸还原酶（DHFR）来抑制多种微生物的生长。我们生成了一种mt-Mtx共轭物，以评估甲氨蝶呤对人类细胞的毒性是否能降低到使其作为抗菌剂具有治疗窗口的水平。实际上，mt-Mtx在多种细菌物种中表现出显著增强的抗菌活性，这是由于其摄取量增加，同时对哺乳动物细胞的毒性降低了1000多倍，这是由于其被隔离在细胞质DHFR之外（图6B）。因此，基于肽的甲氨蝶呤靶向为通过增强细菌摄取和减少哺乳动物细胞的脱靶效应来提高抗菌化合物的效力提供了一种通用策略。
图6.利用线粒体趋向性肽靶向细菌。（A）左：抗菌多脯氨酸肽或甲氨蝶呤（Mtx）-MPP共轭物（红色）可有效靶向细胞外和细胞内细菌（蓝色）。右：阴离子多谷氨酸序列（绿色）中和阳离子线粒体靶向肽（红色），促进巨噬细胞的内吞作用。（1）肽或细菌的内吞作用，（2）细菌的吞噬作用，（3）内体与吞噬体融合，（4）细菌β-内酰胺酶裂解多谷氨酸部分，使肽能够被细菌摄取，（5）将过量的肽隔离在线粒体中，远离细胞质或核成分，从而限制宿主细胞毒性。（B）甲氨蝶呤和mt-Mtx在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）中的治疗指数。
将抗菌化合物与线粒体递送剂结合使用，也是针对能够在哺乳动物细胞内生长的感染性病原体的一种方法。通常情况下，由于化合物必须能够穿过宿主细胞的质膜，所以如果没有递送载体，细胞内的细菌很难被靶向。有趣的是，在 HeLa 细胞中，mt-Mtx 能够以相当的浓度清除浮游态以及细胞质内的单核细胞增生李斯特菌。通过调节肽的阳离子和疏水特性，发现药物在细菌和线粒体中的积累相对比例是可以调节的，阳离子性越高且疏水性越低，与细菌靶向性增强相关。
该策略还被调整用于针对在巨噬细胞内经改造的吞噬体中生长的胞内病原体耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌。由于吞噬体质膜上不存在跨膜电位，仅用阳离子载体难以靶向这些胞内细菌。为了更有效地、特异性地靶向吞噬体内的细菌，合成了 mt-Mtx 前药，其中包含一个阴离子屏蔽基团，旨在促进内吞作用并防止在其他细胞类型中依赖电位的摄取。该屏蔽基团通过头孢菌素连接体与化合物相连，该连接体在肽携带的内体与含细菌的吞噬体融合后，由胞内病原体分泌的β-内酰胺酶以诱导方式裂解。这种机制使得活性 Mtx 共轭物在细菌周围特异性释放，同时允许多余的化合物被线粒体隔离。这种创新方法成功清除了感染巨噬细胞中的耻垢分枝杆菌。
除了肽类物质仅用于化合物的递送外，还对具有固有抗菌活性的线粒体趋向肽进行了研究。Chmielewski 及其同事描述了一种仅由脯氨酸残基组成的合成抗菌肽，这些残基经过阳离子和疏水基团的修饰，以表现出电位依赖性摄取。这些肽对多种细菌病原体具有低微摩尔级的毒性。这些特性相结合，使得它们能够针对细胞内的病原体沙门氏菌和布鲁氏菌。此外，这些肽的长度经过优化，以实现高细胞内渗透性和抗菌活性。这种优化后的肽在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的小鼠皮肤感染模型中，尤其有效于减少细菌载量和促进伤口愈合。综上所述，这些结果表明，赋予线粒体靶向能力的特性也可以用于有效靶向许多传统非靶向抗菌剂难以治疗的细菌种类。
总结与未来展望
总之，线粒体靶向肽可用作有效载体，用于递送探针和治疗剂。我们近期的研究成果表明，这些肽能够有效地递送具有理想药物特性的抗癌药物，探究线粒体生物学以发现具有线粒体功能的新蛋白质，并以对哺乳动物毒性极小的方式靶向细菌。我们抗癌药物偶联物的未来发展方向包括整合肿瘤靶向基团，以进一步减少脱靶效应并扩大治疗窗口。对于具有抗菌活性的偶联物，应分析其在体内的靶向抗菌效果。此外，我们还可以合理设计二级结构，以生成具有特定摄取特性、稳定性和生物利用度的环肽。另一个有趣的领域是将线粒体靶向特性整合到肽模拟物中，用于与线粒体中的特定蛋白质结合或破坏蛋白质-蛋白质相互作用。
利用线粒体肽载体进行小分子靶向需要存在适合肽结合而不影响生物活性的功能基团。未来，应设计策略使肽载体在进入线粒体后能够释放结构敏感的治疗性货物。尽管利用肽载体探究线粒体生物学是一个迅速发展的领域，但用于操控线粒体基因表达的方法开发仍基本处于空白。设计肽载体来传递核酸或类似物（如肽核酸）可能为线粒体的精细基因操控提供一种方法。本综述中所描述的研究仅仅是利用这些多功能肽载体来探究和改变线粒体生物学的令人兴奋的努力的开端。
参考文献：doi.org/10.1021/acs.accounts.6b00277
