研究人员已投入大量精力将肽附着于各种生物材料上，从而实现了多种功能。通过利用肽的优势，诸如高特异性、强效性、成本效益、小尺寸以提高组织渗透性和靶向递送、生物降解性以及新颖的治疗应用等功能，都可以通过将肽附着于生物材料上得以实现。在用于修饰生物分子的各种方法中，化学技术最为成熟，能够有效地将所需的分子固定在特定表面上。

在我司客户沟通过程中，经常有客户需要做生物材料上的多肽偶联服务，但是生物材料偶联为混合物，所以特此整理概述近期研究中用于将肽附着于各种生物材料的化学修饰方法，以供老师们的多肽设计及课题研究使用。

首先需要提前说明的是，生物偶联过程涉及通过共价键或非共价键将至少一种生物材料与两种物质结合的化学反应。与小分子合成相比，共价生物偶联反应通常需要苛刻的条件。因此，在反应过程中保持温度低于37°C、接近中性pH值以及使用水性缓冲溶液对于保持生物分子的结构和功能至关重要。此外，生物偶联反应必须迅速进行，以确保在低底物浓度下短时间内完成偶联。

化学偶联技术被广泛研究且常用于制备生物材料-生物分子偶联物。它们很方便，因为不需要专门的技能或设备。

1 胺基结合

胺基团主要存在于赖氨酸残基、多肽的N端以及寡核苷酸的3'和5'端氨基修饰上，是用于偶联的重要官能团。然而，胺基偶联的一个缺点是其位点选择性低，导致异质性产物异构体的形成。这是因为典型的蛋白质具有众多暴露的赖氨酸残基，它们的反应活性相似。因此，对胺基进行修饰可能会导致不同的生物材料附着在不同的位点，从而显著降低生物活性和功能。这一挑战在短肽序列中也存在，赖氨酸和N端之间会为偶联而产生竞争。尽管存在这些限制，但如果肽序列只含有一种胺基基序，或者低选择性不影响其性能，胺基修饰仍可作为一种可行的偶联方法。

1.1 通过酰胺键形成的胺结合

胺的形成是一个研究颇多的领域，为此产生了多种偶联剂和羧基反应。其中一种广泛使用的方法是与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯反应。在pH值为7.0至9.0的条件下，NHS酯与蛋白质的一级胺基团表现出很强的反应性，与NHS结合物形成稳定的酰胺键。这种方法简单有效，且无需对多肽链进行修饰。NHS酯对胺类物质的选择性很高。然而，其缺点是不溶于水，在高水浓度下会发生水解。相比之下，磺酰-NHS的水溶性更高，在水中水解速度更慢。

NHS常用于与EDC（1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺）进行生物偶联。EDC起到活性交联剂的作用，促进胺与羧酸盐或磷酸盐的偶联。虽然EDC单独使用也能促进胺的偶联，但可能会发生副反应，将中间体重排为稳定的、不可反应的N-酰基脲，从而降低偶联反应的效率。然而，当与NHS结合使用时，NHS酯作为中间体，对水解和重排具有高度抗性，从而提高最终产物的产率。

在粒子结合过程中，保持粒子间的排斥力能显著抑制聚集。虽然 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）容易聚集，但磺基-NHS 由于其强负电荷而不太容易聚集。此外，磺基-NHS 的水解强度更大，因此在 EDC/NHS 偶联反应中比 NHS 更具优势。

EDC/NHS偶联的另一种选择是使用肼而非胺。虽然肼的应用不如胺广泛，但其pKa值更低，在弱酸性条件下不易被淬灭，适合用于酯的活化。这使得肼功能化的肽能够在pH值为5至6的条件下与生物材料结合，部分弥补了赖氨酸残基所具有的位点选择性。

1.2 通过 N 端修饰进行胺基偶联

如前所述，胺类结合通常具有较低的位点选择性。然而，多肽的N端可以通过诸如N端乙酰化和烷基化等反应进行修饰，从而实现选择性结合。由于附近存在羰基，N端胺的pKa值低于其他胺，使其在酸性和中性pH条件下具有特异性。然而，这种方法会导致较低的结合效率，并且修饰可能会改变蛋白质的功能。N端修饰的一个具体例子是还原烷基化，它在酸性条件下发生，并对N端具有选择性。这种方法保留了N端胺，最大限度地发挥了蛋白质的功能并保持了生物活性。它涉及使用醛衍生物，例如苯甲醛衍生物，来生成各种生物共轭物。尽管这种方法对除半胱氨酸以外的所有氨基酸都有效，但对于缺乏半胱氨酸的肽序列的生物材料的位点特异性结合来说，它仍然很有价值。

2 硫醇共轭

在20种氨基酸中，半胱氨酸的巯基是蛋白质中最强的亲核基团。在适宜的pH值条件下，半胱氨酸会优先于其他亲核残基（如赖氨酸或组氨酸）发生烷基化反应。巯基的氧化还原敏感性为其化学修饰增添了更多多样性。由于半胱氨酸中的巯基在氨基酸中具有独特性，因此在重组蛋白中具有高特异性和易于操作的特点。因此，它成为位点选择性多肽偶联的理想靶点。已经开发出了众多与含巯基肽反应的修饰策略，使其在组织工程中得到广泛应用。

然而，巯基修饰也有其局限性。在某些蛋白质中，半胱氨酸可能在高度保守的区域与其他半胱氨酸聚集，或者在不太保守的区域暴露在蛋白质表面。因此，半胱氨酸可以形成结构上的二硫键，或者占据具有重要功能的蛋白质区域，例如催化和辅因子结合位点。即使在短肽中，半胱氨酸残基也对活性起着关键作用，二硫键被用于诱导环化并增强生物活性。因此，对蛋白质或肽中的半胱氨酸残基进行修饰可能具有挑战性。一种在蛋白质表面引入额外巯基的方法是用Traut试剂修饰赖氨酸残基。然而，这会导致对胺的选择性降低。此外，半胱氨酸残基容易氧化的特性在需要精确的修饰化学计量时会成为一个问题，有时需要在结合之前先还原二硫键。

3 迈克尔加成反应

迈克尔加成反应涉及在碱催化下，亲核试剂（如烯醇负离子，即迈克尔供体）与活化的α,β-不饱和羰基化合物（即迈克尔受体）发生加成反应。这是一种在组织工程和蛋白质修饰中广泛用于制备多肽共轭物的方法。特别是硫醇迈克尔加成反应，因其具有反应速率快、产率高且定量、反应条件温和（使用温和的催化剂）等优点，在合成用于基因传递的肽-聚合物共轭物方面备受关注。在此反应中，硫醇单体主要是肽，要么直接引入半胱氨酸，要么在特定位置引入硫醇基团。

反应速度和结合效率主要受三个因素控制：

• 硫醇pKa：在迈克尔加成反应中，硫醇负离子充当活性亲核试剂，其脱质子倾向决定了硫醇负离子的浓度和反应速率。例如，使用弱碱作为催化剂时，具有较低pKa值的芳香族硫醇显示出更高的反应速率。含半胱氨酸的肽的反应性也可能受到周围氨基酸序列的影响。带正电荷的氨基酸（如赖氨酸或精氨酸）的存在会降低硫醇的pKa值，从而提高其反应性。相反，天冬氨酸或谷氨酸残基的存在会提高硫醇的pKa值，减缓反应。因此，在设计肽偶联时，应仔细考虑肽序列。

• 迈克尔受体的反应活性：迈克尔受体的亲电性决定了其反应活性。随着受体电子缺失程度的增加，其对亲核攻击的活性增强，从而加快反应速率。在硫醇迈克尔加成反应中，常用迈克尔受体的反应活性可概括为：“马来酰亚胺＞乙烯砜＞丙烯酸酯＞丙烯酰胺＞甲基丙烯酸酯”

• 催化剂的选择：硫醇-迈克尔加成反应可由多种催化剂引发，包括碱、金属、路易斯酸和亲核试剂。其中，碱和亲核试剂发生副反应的可能性最小。碱使硫醇脱质子，生成硫醇盐阴离子和共轭酸，反应速率和产率取决于碱催化剂的强度和浓度、pKa、pH 值以及硫醇的位阻等因素。然而，碱催化的反应通常需要较长的反应时间、较高的极性、催化剂浓度和温度。另一方面，亲核试剂攻击活化碳的双键，形成两性离子中间体。亲核试剂生成的强烯醇盐碱可使硫醇脱质子生成硫醇盐阴离子。亲核试剂催化的反应即使在低催化剂浓度下也表现出足够的反应活性，但过量的催化剂会导致与乙烯基发生副反应。

因此，在设计有效的结合策略时，对这三个因素进行平衡考量至关重要。例如，过高的反应活性可能会导致不必要的结合或反应成分之间不恰当的混合。因此，恰当地控制反应速率是十分关键的。

3.1 马来酰亚胺基团取代反应

马来酰亚胺由马来酸酐与氨或胺衍生物反应生成，其在pH值6.5至7.5范围内特异性地与硫醇反应。由于其对除硫醇以外的功能基团反应性有限，马来酰亚胺能够区分天然存在的半胱氨酸残基和通过重组技术引入的半胱氨酸残基。马来酰亚胺通常用于通过NHS酯将胺基和巯基连接起来，例如在异双功能交联剂如琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯（SMCC）中。在pH值为7时，马来酰亚胺与巯基的反应速度大约是与胺反应速度的1000倍。然而，在碱性pH值条件下，其与胺的反应性变得明显，而马来酰亚胺则发生水解，不再与巯基反应，因此需要严格控制pH值。此外，马来酰亚胺中的双键由于其两个羰基和电子贫乏的特性而具有高度反应性，使其适合与各种亲核试剂发生反应。N-取代马来酰亚胺因其作为迈克尔受体的快速反应性、无副产物生成以及对硫醇的高度特异性而特别受欢迎。硫醇-马来酰亚胺迈克尔加成反应常用于将功能肽与聚合物连接起来以实现基因传递。

尽管马来酰亚胺偶联通常被认为很稳定，但近期的研究表明，通过逆迈克尔反应，巯基偶联是可逆的。这一发现具有潜在的应用价值，因为据报道在富含巯基的环境中，硫醚琥珀酰亚胺会发生这种反应。此外，在生理pH值和温度条件下，特定的硫醚琥珀酰亚胺在谷胱甘肽存在时会发生逆迈克尔型加成和巯基交换反应。

3.2 苯乙烯砜基团取代反应

乙烯基砜在迈克尔加成反应中与硫醇表现出快速且选择性的反应性，即使存在其他乙烯基也是如此。尽管乙烯基砜的双键与马来酰亚胺相比亲电性较低，但在大多数共轭应用中仍十分高效。此外，与乙烯基砜形成的硫醚键耐水解，使其成为在器件形成过程中确保结构稳定性的可靠选择。选择性通常很高，并且可以通过调整反应的pH值进一步提高。因此，乙烯基砜常用于与各种肽（包括含半胱氨酸的肽）进行共轭。

3.3 丙烯酸酯、丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯基团的取代

丙烯酸酯、丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯是能进行多种反应的活性基团，包括迈克尔加成、自由基介导的聚合、交联和交叉共轭。丙烯酸酯由于易于引入材料和生物分子偶联伙伴中，常被用作迈克尔受体进行共轭。尽管它们的反应速率低于马来酰亚胺和乙烯基砜，但对于大多数生物偶联应用来说，其反应速率仍足够快。酰胺连接的丙烯酰胺为生物材料偶联提供了增强的稳定性，但代价是由于酰胺键的存在导致亲电性降低，从而反应活性降低。甲基丙烯酸酯的亲电性更低，因此对硫醇的选择性更高，但反应速率和效率显著降低。

纳瓦罗等人认为，全球反应性数据表明，进入的亲核性仲胺倾向于从丙烯酸酯和丙烯酰胺单元攻击丙烯酸类物质，而失活的甲基丙烯酸酯和 N-乙烯基吡咯烷酮则需要更苛刻的反应条件，并可能产生副产物。使用丙烯酸酯、丙烯酰胺或甲基丙烯酸酯的条件差异显著。受体之间的反应性差异要求迈克尔供体的亲核性有所不同。例如，甲基丙烯酸酯类烷基相对是较差的迈克尔受体，可能需要更强的亲核试剂，如碳负离子，才能成功进行迈克尔加成。另一方面，更好的受体，如丙烯酸酯或丙烯酰胺基团的烷基，很容易接受较弱的胺和硫醇亲核试剂。

4 二硫键反应

硫醇会自发氧化形成二硫键，这对于诱导和维持蛋白质及肽的稳定性至关重要。通过氧化形成二硫键的过程可以通过提高反应的pH值或加入氧化剂来促进。这一过程可用于多肽偶联、药物递送及其他领域。在最近的一项研究中，引入了一种新的化学蛋白质修饰方法，利用交叉二硫键的形成。该技术利用含半胱氨酸肽中的SCM基团作为激活基团，实现与含半胱氨酸蛋白质的位点选择性偶联。该反应在环境条件下进行，生成的蛋白质-肽偶联物可根据其大小差异轻松与过量的肽分离。然而，二硫键的形成是可逆的，可通过添加二硫苏糖醇（DTT）或三（2-羧乙基）磷（TCEP）等还原剂将其断裂。虽然这一特性在某些情况下可能具有优势，但在需要不可逆修饰的情况下可能会带来挑战。

5 总结

肽在生物材料中的未来前景充满希望和期待。然而，通过化学偶联成功开发肽 - 生物材料共轭物需要肽与所选偶联化学相容，同时保持其生物活性。合成肽与广泛的偶联化学兼容，并且可以被设计成模仿各种蛋白质和生长因子的活性氨基酸序列。然而，在这一领域存在明显的知识空白，所以特此整理相关内容，以供交流学习

参考文献：doi.org/10.1007/s12257-024-00095-5