研究多肽纳米药物的体内转运与代谢，离不开有效精确的分析方法，目前常用的研究方法有液相色谱法、质谱法、荧光标记、放射性同位素标记法以及同步辐射分析等方法，分别通过测定标记物的浓度、质谱分子离子峰、荧光强度、放射性强度或通过测量X射线被样品吸收后能量的变化，来获取局部样品信息，以实现在动物体内跟踪和监测目标药物及其代谢物的目的。

1 液相色谱-质谱联用（LC-MS）法

液相色谱法是传统的药物代谢检测方法，能将组织中不同的药物组分分离并进行检测。LC-MS法是在液相色谱法基础上发展起来的更为现代化的方法，具有灵敏度高、分析快和选择性高的优点，可用于探索药物母体及代谢产物的结构，并提供质荷比（m/z）等相关数据，在多肽药物和抗原抗体的体内定量分析中已有较多应用。西班牙巴塞罗那生物医学研究所开发应用LC-MS法检测CD-1雌性小鼠体内的环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）肽聚氨酯-聚脲纳米药物，并对其药代动力学及生物分布进行了研究。日本东北大学设计合成了用于治疗小鼠肺腺癌常山酮聚合多肽纳米胶束，也应用LC-MS法对药物在不同器官的分布进行了研究。由于纳米结构的多肽药物尺度小、用量少，应用LC-MS检测也存在样品预处理复杂、不能进行实时监测以及检测结果可能受内源性物质干扰等诸多问题，多肽纳米药物的体内代谢研究仍需要探索开发更优的检测方法。

2 荧光标记法

荧光标记法是目前较为常见的标记方法，与LC-MS法相比，荧光标记药物能通过小动物活体成像技术对药物的生物分布情况进行更直观地观察，具有易于操作、灵敏度高等优点。同时，由于荧光标记法需要应用具有独特光学性能的荧光基团进行标记，存在药物性质可能受影响以及产生荧光猝灭效应等缺点，在选择药代动力学分析方法时，需综合考虑实际需求和实验条件，选取适合的方法开展研究。目前研究中应用较多的荧光标记物有花菁（cyanine，Cy）系列荧光染料（如Cy5.5和Cy7）、吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）荧光染料、近红外（near infrared，NIR）花菁荧光染料和近红外亲脂性长链碳菁荧光染料（1，1′-dioctadecyl-3，3，3′，3′-tetramethylindotricarbocyanineiodide，DiR）等，为肽基纳米纤维、肽脂质纳米颗粒、肽偶联多壁碳纳米管等多种不同结构多肽纳米药物的体内分布提供了研究证据。部分药物本身也具有自发荧光的特性，如姜黄素和多柔比星等。这些药物经多肽修饰后，能在不连接荧光基团的情况下，产生自发荧光应用于活体成像。例如，有研究设计合成了多肽修饰的多柔比星纳米药物，通过测定离体器官中多柔比星自发荧光的强度，发现该药物给药24h后在卵巢癌小鼠肿瘤部位的药物浓度为（12.06±3.65）μg·g-1，而游离多柔比星在给药24h后在卵巢癌小鼠肿瘤部位的浓度为（0.34±0.13）μg·g-1，为多肽纳米药物改善循环分布提供了证据。近年来随着标记材料和方法的不断发展，具有独特光电效应的纳米材料量子点（quantum dot，QD）也得到越来越多的关注，已在抗体、RGD多肽的标记及体内监测方面有所应用，为多肽纳米药物的体内行为、靶向特性和药代动力学特征研究提供了更多证据。

3 放射性标记法

同位素示踪技术是利用放射性同位素和稳定性同位素标记化合物作为示踪剂，通过追踪同位素确定化合物动态分布和代谢规律的技术。放射性同位素是指具有不稳定原子核的同位素，这些同位素能够自发地释放出粒子或电磁辐射。相比于放射性同位素，稳定性同位素（如¹³C）具有稳定的原子核，不会自发核衰变。然而，由于稳定性同位素检测灵敏度不及放射性同位素，且其标记化合物费用高、样品制备繁琐等问题，稳定性同位素的应用不及放射性同位素广泛。

放射性同位素标记技术发展迅速，其中金属放射性同位素和非金属放射性同位素已被应用于多肽纳米药物的体内研究中。金属放射性同位素如64Cu，68Ga和89Zr等通常可经螯合剂偶联到多肽结构上，进而对进入体内的多肽药物进行定位；非金属放射性同位素如¹⁸F，¹¹¹In，¹³¹I和¹⁷⁷Lu等也在多肽纳米药物的标记和成像方面有所应用。放射性同位素标记法具有灵敏度高、可实时监测等优点，同时，相较于荧光标记法，不受光淬灭效应的影响，能在长时间或高光强条件下仍能保持稳定性。放射性标记法也存在一些局限性，例如放射性标记物产生辐射可能对人体带来健康风险、放射性同位素标记可能会改变多肽原有空间结构等。使用放射性同位素¹⁴C、³H合成多肽可以保持多肽原有空间结构，但由于其成本高、制样繁琐，目前应用较少。

金属放射性同位素中，⁶⁴Cu由于其低β能量特性和商业可用性引起了研究人员极大关注。斯坦福大学分子成像项目早先进行了相关研究，设计了⁶⁴Cu标记的四聚体RGD肽用于改善肿瘤靶向性，并对药物的代谢稳定性和血液清除率进行了研究。在有关黑色素瘤的药物治疗研究中，以⁶⁴Cu标记的具有内在自螯合特性的酪氨酸酶相关蛋白2（tyrosinase-related protein 2，Trp₂）肽组装纳米颗粒，已被用于在动物实验中追踪药物及体内成像。此外，研究设计的⁶⁴Cu标记的多功能树突纳米探针，不仅能在体外特异性靶向过表达叶酸受体的癌细胞，而且能在体内靶向表达叶酸受体的异种移植肿瘤，并可通过正电子发射断层扫描（posi⁃tron emission tomography，PET）成像进行监测。金属89Zr用于标记纳米颗粒展现出优良的稳定性，当前已有研究设计使用⁸⁹Zr标记抗体金纳米颗粒、高密度脂蛋白纳米颗粒和铂-二氧化钛共轭肽纳米颗粒等进行药物靶向递送研究，且在胰腺肿瘤、乳腺癌和前列腺癌等动物模型中得以应用。

⁶⁸Ga可以直接或通过连接螯合剂间接对大分子蛋白质或者多肽进行标记，在肿瘤诊疗类药物的显像中具有重要地位。⁶⁸Ga标记的多肽类药物主要用于受体分子的靶向显像，如生长抑素受体、胃泌素释放肽受体和缓激肽B1受体等，因此在乳腺癌、神经内分泌肿瘤和胃肠癌等多种肿瘤的诊断及治疗中有所应用。在乳腺癌有关药物治疗研究中，⁶⁸Ga标记的自组装纳米颗粒在MDA-MB-468荷瘤小鼠血液中的保留时间延长，显著增强了肿瘤PET成像效果。有关癌症淋巴结转移的药物治疗实验中，设计合成的⁶⁸Ga标记的两亲性交替共聚物纳米颗粒，也为放射性探针用于淋巴结转移成像提供了更多实验证据。

4 同步辐射技术

同步辐射技术是一种先进的光学技术，能够通过X射线吸收光谱（X-rayabsorption spectroscopy）、同步辐射X射线荧光分析（synchrotron X-ray fluo⁃rescence，SRXRF）和扫描透射X射线显微成像（scanning transmission X-ray microscopy，STXM）等手段，精确表征纳米药物的结构、组成和相互作用，具有高分辨、高灵敏、元素特异和样品制备简单等优点。由于自然环境和生物体系复杂，纳米材料及多肽纳米药物在生物体内的转化研究仍面临重大挑战，基于同步辐射技术的研究方法在多肽纳米药物的体内转化研究方面具有重大的应用前景。目前，同步辐射技术多用于金属元素的追踪，已在纳米药物的体外细胞内表征和定位中有所应用。Pascolo等应用SRXRF光谱对纳米颗粒的细胞内吸收和定位进行了表征，不仅对金属元素钠和铁进行了定位，还对非金属元素碳和氧进行了分析。在体内分析方面，已有研究应用SRXRF对含MoS2的纳米复合物进行了成像分析，确定了钼在肝窦结构中沿血管周围成放射状分布的特点。同步辐射技术为多肽纳米药物的体内代谢研究提供了新思路，然而，由于对同步加速器设施的访问有限，这也使得大批量样品的分析受限，该技术也存在难以实现药物的动态跟踪、成像和数据处理复杂等缺点。同时，SRXRF虽然可以在亚微米空间分辨率下提供元素分布的数据，但由于其分析基于X射线光子照射样品，因此会引起生物样品的辐射损伤，进而导致样品的质量损失，在应用该技术进行分析时仍需进行综合考虑。