肽自组装的生成方法多种多样。在不同条件下，相同的肽可以形成截然不同的组装体，包括α螺旋和β折叠二级结构以及纳米纤维、纳米颗粒和纳米管超分子结构。溶液配制方面的考虑因素，如添加盐或缓冲液、调节 pH 值和温度以及物理处理，已被证明会影响肽的组装模式，因此可以作为预测和调节肽组装结构的另一种工具。

1、盐类和缓冲液

盐或缓冲液常被添加到肽混合物中，通过霍夫迈斯特效应来启动或改善肽的组装。霍夫迈斯特效应指出，溶液中高浓度的阴离子和阳离子会影响驱动肽和蛋白质折叠的疏水相互作用；这些离子被称为结构稳定剂和结构破坏剂，可以有意添加到溶液中以改善或破坏肽和蛋白质的相互作用。结构稳定剂是高度水溶性的阴离子，能增强疏水相互作用，从而促进肽的组装。相反，结构破坏剂会干扰水性环境中的疏水相互作用，破坏肽的组装。磷酸盐缓冲盐水（PBS）是一种常用的结构稳定剂，添加到肽溶液中以触发组装。虽然肽的二级结构在添加盐后基本不受影响，但不同盐的加入已被证明会改变肽组装的超分子结构，如图1 所示。

图1 在存在 A）磷酸盐、B）氯化钠盐和 C）硫氰酸钠盐的情况下自组装肽凝胶的原子力显微镜图像。比例尺代表 500 纳米。

芳香二肽FmocYL在三种不同的盐溶液中进行了检测。磷酸盐作为结构稳定剂，增加了水的有序性；硫氰酸盐作为结构破坏剂，破坏了水的有序性；氯化物则是一种介于两者之间的盐。结构稳定剂磷酸盐促进了单向纤维的形成，而结构破坏剂硫氰酸盐则破坏了纤维的形成。作为介于两者之间的盐，氯化物允许无序纤维的形成。此外，20个氨基酸的阴离子融合肽（GLFEALLELLESLWELLLEA）与K16肽在PBS中混合，形成了均匀的球形纳米颗粒群。这些纳米颗粒表现出盐浓度依赖性的生长，在盐浓度增加到150×10−3mNaCl时，其流体动力学直径增大。这种组合纳米颗粒具有通过内吞作用将疏水分子递送至细胞质的潜力。

大多数肽纳米载体是通过将原始肽加入去离子（DI）水等溶剂中在溶液中形成的。然而，有些肽必须溶解在有机溶剂中，并用含水溶液透析才能组装。例如，肽序列cyclo[-(L-Gln-D-Tle-L-Glu-DTle)2-]及其对映体在33%（体积比）乙腈-水溶液中自组装成基于β折叠片的纳米管。肽组装的另一种有机溶剂示例是KS5-DEAP2-A488和KS5-DEAP2-BHQ-1的混合物，它们的设计使得赖氨酸残基上的三个主要氨基基团可用于彼此连接。这两种KS5变体在二甲基甲酰胺中混合后，再用Tris-HCl缓冲液透析，从而形成类似囊泡的pH敏感纳米颗粒。这两种变体中的每一种都与不同的荧光染料连接，当在溶液中混合时，这两种构建单元交替排列，形成双层结构，折叠成球形纳米颗粒。这种荧光染料在暴露于酸性肿瘤微环境时会改变强度，使得纳米粒子可用作肿瘤探针，用于肿瘤内部和静脉肿瘤成像。这两种组装体都是用双肽系统制成的，这表明有机溶剂可能有助于某些多肽组装体的形成。

在设计自组装肽时，盐浓度和缓冲溶液是重要的考量因素。向肽溶液中添加磷酸盐或钠盐等亲水剂，会提高水的有序性，从而促进进一步的组装，例如纳米颗粒延伸成纤维或纳米颗粒直径增大。[还应考虑有机溶剂；尤其是在双肽配方中，有机溶剂与水溶剂进行透析可促进均匀的自组装。

2 pH 值和温度

肽组装发生的环境会影响肽组装的程度和性质。因此，诸如pH值和温度之类的化学或物理环境因素可用于控制肽的组装。改变这些参数可以引发不同程度的肽折叠和组装。例如，在溶液中将肽缓冲至特定的pH值可以实现肽向所需结构的可控且可靠的组装。大多数为生物医学和药物输送应用而设计的肽以羧基和氨基终止，它们分别在高于或低于其pK值的溶液中去质子化或质子化。此外，肽序列中还可以包含侧链以羧基或氨基终止的氨基酸，以增强质子化或去质子化的效果，提高电荷特异性敏感度。这一原理可用于设计pH敏感肽，其自组装可通过pH值调节，或者pH值的调整可改变组装类型。例如，一个由11个氨基酸组成的序列P11，在每个变体中被替换了一个或两个残基（P11-2、P11-3、P11-4、P11-5），并在不同pH值的水溶液中进行了检测。如图2所示，每个肽变体在pH值2至12的范围内形成了具有不同组装相的水凝胶。尽管这些P11肽水凝胶变体的一级序列非常相似，但在测试的pH范围内却表现出截然不同的相特征。该实验表明，肽组装的pH依赖性在很大程度上取决于一级序列的内在特性。

图2 肽在水溶液中 pH 值依赖性组装成不同相

温度也可用于操控肽的折叠和组装。已有研究表明，蛋白质折叠中的疏水作用与温度有关。疏水作用导致疏水残基被埋藏在蛋白质的中心以避免与水溶液接触。这是因为液态烃在水溶液中溶解度很低。因此，从能量角度而言，它们向蛋白质中心的有机相转移是有利的。疏水作用对温度敏感，因为触发组装所需的热能数量取决于每个序列特有的静电相互作用和关联。随着温度升高，疏水氨基酸残基被隐藏起来，从而推动肽的折叠和组装。多项研究已证实，肽的组装在一定程度上取决于温度。

值得注意的是，人们常常观察到pH值、温度和离子浓度之间的相互作用能够决定肽的折叠和组装方式。一项研究表明，MAX1肽的温度诱导组装过程受pH值影响。MAX1肽有多个赖氨酸侧链，在pH值升高时会去质子化。在pH值为9.7的溶液中，大部分赖氨酸都去质子化了，因此不需要太多热能就能触发组装成β折叠纤维状水凝胶。而在pH值为9的溶液中，只有少量赖氨酸去质子化，所以需要更高的温度才能诱导自组装。最后，在pH值为8的溶液中，没有赖氨酸去质子化，无论温度如何都不会观察到组装现象。在另一项研究中，四种不同的肽序列分别在四种不同pH值和NaCl浓度的溶液中孵育。这些肽被设计成形成淀粉样纤维结构，并使用淀粉样纤维特异性染料进行分析。在每种组合中识别出的淀粉样结构数量取决于肽序列中的七肽重复序列和酪氨酸，以及pH值为7的PBS溶液。因此，在预测肽组装时，考虑溶液条件的所有方面是很重要的。

3 样品处理与表征

有时需要对肽样本进行额外的物理操作步骤才能实现理想的肽组装，例如过滤、超声处理或离心。这些步骤可能有助于实现所期望的组装肽的结构、大小或负载能力。然而，某些分析方法，如电子显微镜分析，可能需要替代或额外的样本制备。一个潜在的担忧是，特定分析方法所需的替代处理步骤可能会改变组装肽的结构和性质，从而导致结果不一致。为了尽量减少不同表征实验中结构的差异，应在各种分析中尽可能保持样本制备方法的一致性。或者，如果某些分析方法必须对组装方法进行差异处理，可以通过多种表征方法对组装结构进行比较，以确认由于制备步骤的不同而导致的组装结构变化最小。

参考文献：doi.org/10.1002/mabi.202100347