在为任何应用设计肽组装体时，确定氨基酸序列通常是第一步。在确定肽自组装行为时，局部效应、非局部效应、电荷分布和芳香族残基是需要考虑的重要因素。局部效应是指氨基酸残基自身形成特定二级结构的内在倾向。例如，在肽组装过程中包含具有芳香族基团的氨基酸会导致稳定相互作用，从而影响超分子结构。相比之下，非局部效应是指序列中单个氨基酸的位置以及氨基酸之间吸引力对精确链折叠的影响。非局部效应的一个重要贡献因素是极性和非极性残基的周期性。研究表明，在自组装寡聚肽中，序列的周期性比单个残基形成α螺旋或β链的内在倾向更为重要。通过重新排列序列中的残基，以产生不同的电荷分布模式，也可以对二级结构和超分子结构进行修改，并且可以设计包含反应性侧链的序列，从而实现交联和化学修饰。本节描述了由于肽序列的局部和非局部效应而形成的结构趋势。

1 局部效应

肽序列的局部效应根据每个氨基酸形成特定结构的倾向性来决定二级结构。通过分析含有目标残基的天然蛋白质的结构，可以确定氨基酸形成特定结构的倾向性；例如，已确定亮氨酸、谷氨酸和赖氨酸具有内在的α螺旋特性。因此，可以根据氨基酸残基的内在特性来选择特定的氨基酸序列，以产生所需的结构。

设计肽 RADA16 的氨基酸序列因其可靠重现的β折叠纳米纤维而被选中。该序列具有交替的带电和疏水残基，这促进了β折叠的形成。RADA16 纳米纤维由两个堆叠的β折叠组成，每个β折叠由平行的β链构成，其结构由正电荷的精氨酸残基与负电荷的天冬氨酸残基交错排列而稳定。非极性的丙氨酸残基形成疏水内核，而极性的精氨酸和天冬氨酸残基则构成纤维的表面。RADA16 肽用于构建纳米纤维网络，用于组织再生、三维细胞培养和药物输送。MAX8 肽在生理条件下也能形成固体水凝胶，可用作姜黄素的可注射输送载体。由四个残基序列 VDPPT 重复构成的稳定 20 氨基酸肽，采用 II 型β转角二级结构。MAX8 肽通过链内氢键稳定，其β发夹的相对两面分别由疏水的缬氨酸和亲水的赖氨酸残基组成。纤维的形成是由疏水侧链相互作用以及沿纤维轴的横向氢键作用所导致的，这赋予了水凝胶机械刚性。此外，研究表明，氨基酸序列的微小变化会影响超分子结构的形成。一项研究证明，仅仅两个氨基酸的差异就能改变 X4-2-6 肽的组装，这种肽是 CXCR4 化学趋化因子受体的跨膜拮抗剂，可形成纳米颗粒。去除两个 N 端的亮氨酸残基后，肽就组装成了纤维。随后在 C 端用聚乙二醇进行修饰，成功地防止了聚集，同时又不影响自组装。X4-2-6 自组装纳米颗粒在体外抑制 CXCR4 功能，从而在体内阻碍了依赖 CXCR4 的肿瘤转移，并能够封装疏水性药物，提供了一种双重作用的递送系统。

在从头设计肽序列时，通过选择对所需结构有更高倾向性的氨基酸来考虑单个氨基酸的局部效应可能是有用的。然而，仅基于局部效应很难准确预测二级或超分子结构。芳香族基团是这一说法的一个例外。

2 芳香族基团

芳香族基团是侧链具有环状结构的氨基酸，由于芳香族基团间的相互作用比烷基链间的相互作用更强，因此常用于制备水凝胶。分子间的芳香族相互作用能改善水溶液中水凝胶的自组装；在肽序列中加入芳香族基团可使纳米纤维网络发生水凝胶化，提供稳定力并形成稳定的水凝胶。芳香族基团也被发现有助于淀粉样纤维的自组装。淀粉样纤维是体内自然形成的蛋白质聚集体。极性和不带电荷的氨基酸，如谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸、丝氨酸和甘氨酸，被称为朊蛋白结构域（PrDs），对于形成这些淀粉样纤维结构是必需的，并有助于片层间的稳定和片层内的稳定。利用酪氨酸的芳香族相互作用成功制备了定制的朊蛋白启发型纳米结构。这些朊蛋白启发型纳米结构已被用于组织工程、药物递送、粘合材料、可生物降解纳米复合材料、纳米线和生物传感器。

在肽序列中引入芳香族基团可增强二级结构和超分子结构的稳定性。肽序列中芳香族基团的分布模式可能会诱导形成不同的超分子结构。在序列中以交替模式使用大量芳香族残基会形成β折叠淀粉样纤维，仅在序列末端使用一两个芳香族残基会形成水凝胶，而在长序列的中心附近使用少量芳香族残基可能会促进纳米粒子的形成。含芳香族基团的水凝胶和纳米粒子中的二级结构包括β折叠、α螺旋和卷曲螺旋。因此，应根据芳香族残基的数量和分布模式来考虑在自组装肽序列中使用芳香族基团，以实现淀粉样纤维、水凝胶或纳米粒子的形成。

3 非局部效应

虽然每种氨基酸都有影响肽结构的内在倾向，但序列中残基的位置决定了肽结构自组装的主导力量。氨基酸的排列顺序决定了肽序列的类别，例如交替序列或两亲性肽。氢键是肽序列组装的主要驱动力，在水溶液中形成内部疏水核心和外部亲水层。这种现象被称为疏水效应；当引入水中时，同时具有极性和非极性区域的肽有通过疏水相互作用自组装的自然倾向。因此，极性和非极性氨基酸的分布模式在很大程度上影响肽的折叠和超分子组装。此外，带电残基之间的静电相互作用有助于确定二级结构和稳定，尤其是在β折叠结构中。

例如，具有 VEVE 模式的 16 碳序列（C16H31OVEVE）会自组装成扁平纳米带，将表位递送至细胞以用于免疫疗法。VEVE 采用β折叠结构，但亲水和疏水侧链翻转到肽链主链的相反侧，导致曲率丧失和横向生长。当非极性的缬氨酸和带电极性的谷氨酸残基重新排列，形成具有 VVEE 序列的新模式时，在相同条件下纳米结构会获得曲率，形成圆柱形纳米纤维。此外，仅由具有内在形成α螺旋倾向的氨基酸组成的肽序列，但以有利于β折叠的模式排列，会形成β折叠。肽序列 EAK16（AEAEAKAKAEAEAKAK）由有利于形成α螺旋的残基组成，但由于交替的电荷和极性模式，可靠地形成β折叠二级结构。根据盐浓度的不同，EAK16 可以结合成由交织的丝状物或纳米纤维组成的宏观膜，可用于组织工程应用中的生物支架。

文献中的趋势表明，包含交替氨基酸的区域会使肽倾向于形成β折叠二级结构和纳米纤维超分子结构。极性、电荷和芳香结构不同的氨基酸交替排列可实现β折叠相互作用，而电荷交替排列对于形成纳米纤维组装体最为有效。基于局部效应预测α螺旋二级结构尚不明确；形成α螺旋或卷曲螺旋二级结构的序列通常由非极性和芳香基团的复杂模式组成，其中带电或极性基团的数量各不相同。具有α螺旋二级结构的自组装肽通常源自具有类似结构的天然肽，而非从头设计。因此，由于初级序列、局部效应和α螺旋二级结构之间缺乏明确的趋势，从自然界中衍生和改造的序列可能是设计功能性α螺旋序列最有效的方法。

4 电荷分布

在预测自组装肽的二级结构和超分子结构时，电荷分布是必须考虑的因素，因为它们会取代肽折叠的内在倾向。正负电荷控制着哪些氨基酸片段通过静电作用力聚集在一起，还能决定序列可用于哪些应用。例如，高度阳离子的序列可能会产生细胞毒性，从而限制其在体内的应用。控制序列电荷的一种方法是在肽的两端进行 N 端乙酰化和 C 端酰胺化。这两种方法都用于中和电荷，并模仿蛋白质以防止体内由外肽酶引起的降解。与纳米纤维相比，当电荷失衡更大时会形成纳米球；N 端额外的负电荷有助于肽自组装成具有重现性的球形纳米颗粒。

影响电荷分布最常见的方式是改变整个序列中带电肽的分布模式。EAK16 通常具有 II 型电荷分布（-++-++），并形成纤维状结构。如果将该序列改变为 EAK16-IV，具有 IV 型电荷分布（--++++），则不再观察到纤维结构；相反，该序列会形成球状组装体。TAT（YGRKKRRQRRR）序列是一种细胞穿透肽，可实现膜转运，最初是从人类免疫缺陷病毒（HIV）的转录激活蛋白（TAT）中获得的。肽两亲物 CG3R6TAT 由亲水的 TAT 序列、六个精氨酸残基（增加阳离子电荷以改善膜转运）和一个疏水的胆固醇块（促进自组装）组成。阳离子电荷和疏水胆固醇块驱动肽组装成纳米颗粒，其中 TAT 序列位于外表面。由于能够穿过血脑屏障，CG3R6TAT 肽纳米颗粒被用作脑部的抗菌剂。

在从头设计肽时，考虑电荷问题时，应重视末端修饰以及序列中带电氨基酸的位置。为减少体内降解，肽的两端应通过 N 端乙酰化和 C 端酰胺化来中和。在肽序列的 N 端添加负电荷可诱导纳米颗粒形成，而正负电荷交替则可促使β折叠纳米纤维形成。

参考文献：doi.org/10.1002/mabi.202100347