肽侧链上存在各种活性功能团，例如羧基、羟基、氨基和硫醇基，使得多肽高度适应各种化学修饰。肽侧链上存在各种活性功能团，例如羧基、羟基、氨基和硫醇基，使得多肽高度适应各种化学修饰。它利用肿瘤微环境中普遍存在的酸性条件选择性地递送治疗药物。随着我们对pHLIP生物物理特性的理解不断加深，其在低pH环境下的靶向能力证明了它是一种有效的诊断或治疗药物载体。
pHLIP是由36个氨基酸组成的肽，源自细菌视紫红质的第三跨膜螺旋（序列：GGEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT）。在中性pH下，pHLIP缺乏明确的结构，主要呈无规卷曲构象。然而，在酸性更强的条件下，pHLIP会从无规卷曲转变为α螺旋结构，并进行折叠和定向插入膜双层膜。pHLIP的插入pKa约为6.0，这表明其在微酸性环境中会被激活。这种膜插入过程既可逆又单向，N端通常留在膜外，而C端穿过膜，从而为不可渗透的药物进入细胞开辟通道，并选择性地靶向外部环境呈酸性的细胞。
图1. pHLIP在中性pH下形成无规卷曲构象，在较低pH值下由无规卷曲转变为α螺旋结构。pHLIP介导的序列和各种载体系统。
细胞表面的pH值与细胞的糖酵解活性相关，而糖酵解活性会因葡萄糖或脱氧葡萄糖的添加而变化。由于糖酵解活性较高，转移性癌细胞的表面pH值低于非转移性细胞，这增强了pHLIP插入脂质层的可能性。此外，pHLIP对醚脂质膜的亲和力高于酯脂质膜。在醚脂质膜中，pHLIP的运动受到更多限制且螺旋性更强，而在癌细胞中，醚脂质的表达上调，可作为多种疾病的生物标志物。因此，pHLIP特别适合靶向肿瘤细胞。此外，肿瘤血管内皮细胞呈酸性，进一步支持了pHLIP的靶向能力。
研究表明，pHLIP 膜插入主要受分子结构动力学以及其临近转变 pH 值时的变化影响。这些变化包括脯氨酸 - 苏氨酸主链的异构化、精氨酸 - 天冬氨酸桥的破坏、精氨酸 - 脂质相互作用的形成以及脂质头部基团和烷基链动力学的普遍降低。该过程被认为是由酸诱导的质子化启动的，尤其是由于关键残基天冬氨酸/谷氨酸，天冬氨酸 14 与脂质磷酸基团之间的静电相互作用是 pKa 变异性的主要贡献因素。
随着pHLIP研究的不断推进，人们认识到野生型pHLIP（WT-pHLIP）的应用受到一些关键因素的限制，比如体内清除速度慢以及羧基末端电荷对膜插入过程的影响。为了克服这些局限性，研究人员尝试通过修改pHLIP的氨基酸序列来设计具有增强性能的pHLIP衍生物。目前，对pHLIP序列进行修改的主要方法包括：（1）截断或反转WT-pHLIP序列的膜插入端；（2）部分或全部将跨膜天冬氨酸残基替换为谷氨酸、带正电荷的赖氨酸残基或质子化的非标准氨基酸（γ-羧酸、α-氨基乙醛酸）。这些修改，以pHLIP变体3（切除膜插入端）为例，有助于减少pHLIP所带电荷，加快其进入细胞膜形成跨膜螺旋的速度，并提高其肿瘤靶向效率。另一种衍生物pHLIP变体7被设计为在加速血液中清除的同时保持有效的靶向性，从而促进体内药物输送。当前的序列修改策略可为pHLIP衍生物的进一步改进提供灵感。需要特别注意的是，pHLIP序列中的第14位和第25位天冬氨酸残基以及第20位脯氨酸对于pH依赖性靶向活性至关重要。在这些位置进行改变可能会削弱肽插入膜的能力。
pHLIP主要用于药物输送，其中所输送的货物可通过二硫键或其他在细胞内还原环境中易于断裂的连接点连接到C端（图2a）。因此，将货物连接到C端有助于细胞内输送，而连接到N端则可用于标记肿瘤细胞，在癌症成像应用中可能发挥重要作用。通过修改氨基酸序列和链长，已对各种pHLIP变体进行了工程改造，以优化细胞摄取。
图2. pHLIP在正常组织和肿瘤中的作用机制及其在不同领域的应用。（a）pHLIP的典型氨基酸序列以及利用pHLIP及其变体设计货物递送肽或细胞穿透肽（b）EGFP-WT-pHLIP 的结构及其在 HeLa 细胞中对 pH 的响应。(c) PEG-2WT 和 PEG-4WT 方案及其在不同浓度下在 pH 7.4 和 pH 6.0 培养的癌细胞中的效力。（d）pHLIP 介导的 PNA 抗 miR 递送示意图，以及裸鼠体内 Alexa Fluor 750 标记的 pHLIP 的荧光。（e）PNA 与 DNA 片段重组形成纳米颗粒的过程。
pHLIP可有效用于肿瘤细胞的荧光成像。弗罗洛娃等人通过将荧光蛋白（分子量约为28千道尔顿）与pHLIP的N端或C端融合，开发出一种EGFP-pHLIP杂合分子（图2b），并观察了pHLIP介导的EGFP进入细胞的机制。通过金属亲和层析纯化的蛋白质-肽杂合结构具有很高的水溶性，并在体外对HeLa细胞进行了测试。采用两种不同的监测技术，发现当pH值低于6.8时，EGFP-pHLIP与细胞的结合亲和力增强。共聚焦显微镜显示细胞内存在荧光，细胞膜处可见强烈的荧光。此外，使用特定的内吞抑制剂，确定了EGFP-pHLIP的内化是通过多种类型的内吞作用发生的。总体而言，这些结果表明蛋白质-pHLIP杂合结构有望成为肿瘤成像标记物，并可能有助于开发靶向癌症治疗方法。
变体：变体Var3
单字母 H2N-ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT-OH
多字母 H2N-Ala-Cys-Glu-Gln-Asn-Pro-Ile-Tyr-Trp-Ala-Arg-Tyr-Ala-Asp-Trp-Leu-Phe-Thr-Thr-Pro-Leu-Leu-Leu-Leu-Asp-Leu-Ala-Leu-Leu-Val-Asp-Ala-Asp-Glu-Gly-Thr-OH
氨基酸个数 36
分子式 C191H285N43O56S1
平均分子量(MW) 4111.63
诸如鹅膏蕈碱和α-鹅膏毒素之类的毒素是极性环状毒素，天然状态下无法穿透细胞膜，它们能够抑制细胞增殖并具有抗癌特性。尽管这些毒素具有作为抗癌药物的潜力，但由于它们对肿瘤细胞缺乏特异性且无法穿过细胞膜，因而无法用于治疗。然而，当这些毒素与 pHLIP 相结合时，它们能够有效地被递送至细胞质，并在多种肿瘤模型中显示出高效性。这种方法实现了毒素的靶向递送，有可能克服其天然属性所带来的挑战，并增强其在癌症治疗中的适用性。
变体：变体Var7
单字母 H2N-ACEEQNPWARYLEWLFPTETLLLEL-OH
多字母 H2N-Ala-Cys-Glu-Glu-Gln-Asn-Pro-Trp-Ala-Arg-Tyr-Leu-Glu-Trp-Leu-Phe-Pro-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Leu-Glu-Leu-OH
氨基酸个数 25
分子式 C143H210N32O41S1
平均分子量(MW) 3065.45
pHLIP在癌细胞表面的有效靶向已被证明对多种应用有益，例如肿瘤成像和将治疗剂递送至细胞内。怀亚特及其同事开发了pHLIP构建体，显著提高了向肿瘤细胞递送药物的精度。所研究的构建体包括pHLIP束（通过聚乙二醇连接的两个或四个pHLIP）以及具有非标准氨基酸γ-羧基谷氨酸或甘氨酸-亮氨酸-亮氨酸基序的Var3pHLIP。这些pHLIP变体能够形成紧凑的螺旋构象，并通过提高细胞通透性和血液循环时间来改变其生物分布。与单独的pHLIP相比，由聚乙二醇连接的多个pHLIP组成的分子在pH值从8降至6时，磷脂双层插入的比例更高。这些构建体的性能在体外和体内均进行了评估，并与先前版本的pHLIP进行了有效性比较。
在过去十年中，针对基因核心的癌症治疗策略，尤其是针对微小RNA（miRNA）的研究兴趣显著增加。某些miRNA，即所谓的癌基因miRNA，由于其过度表达，与癌症的发展和增殖有关。抑制这些miRNA的一种有前景的方法是使用反义寡核苷酸，如肽核酸（PNA）。PNA旨在模拟DNA，由带电中性的肽骨架构成，该骨架由功能化的N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元组成。Cheng等人提出将PNA连接到pHLIP结构上。由于肿瘤的微环境pH值为6.0-7.0，低于正常组织（pH7.4），这种结构能够通过pHLIP的酸性膜穿透机制有效地将PNA递送至肿瘤组织，从而有效抑制肿瘤生长（图2d）。它们独特的假多肽结构使其不受核酸酶和蛋白酶的降解（图2e）。在反义寡核苷酸中，PNA以其与互补RNA和DNA序列的高亲和力和热稳定性而著称。尽管肽核酸（PNAs）具有潜在的应用价值，但其应用仍面临重大挑战，主要是由于细胞摄取率低。这些亲水性结构常常会被内体捕获，并且会被网状内皮系统清除。这些障碍极大地限制了PNAs在临床治疗中的效果。
pHLIP能够高效地递送多种药物，包括小极性毒素、DNA修复抑制剂、成像剂、纳米颗粒和肽核酸（PNAs），专门针对体内酸性环境。在pHLIP递送的众多货物中，PNAs尤为引人注目。它们是无毒的、序列特异性的DNA类似物，能够通过靶向微小RNA和信使RNA来调节基因表达，对常规药物难以治疗的肿瘤靶点显示出显著疗效。尽管pHLIP是一项很有前景的技术，但提高pHLIP货物构建体的合成效率将极大地增强其在临床应用中的潜力。最近的研究发现，出现了多种pHLIP变体和新的偶联方法，这拓宽了pHLIP在肿瘤微环境的酸性和低氧条件下递送能力的范围。这种能力的扩展为癌症治疗和诊断开辟了新的途径，进一步巩固了其在现代治疗策略中的地位。
参考文献：doi.org/10.1021/acs.biomac.4c00688
