双环肽兼有单克隆抗体（高亲和力，可作用于PPIs）和小分子药物（可透过生物膜）的优势特征，对靶点的亲和力和选择性进一步提高。此外，结构中2个肽环可以具有不同的性质，一个环可以提高细胞穿透能力，另一个环负责与靶点结合；2个环也可以分别结合不同的靶点，从而展示出双功能的特点，这也是双环肽独特的优势。基于这些优点，双环肽已经成为新药研发的热点领域。

1 结构特点

双环肽，顾名思义是结构中含有2个环的肽，目前对双环肽结构的分类尚未有明确的定义，本文将常见类型的双环肽进行了结构划分，具体分为如下4类（图1）。

图1 双环肽的分类（类型I：a，连接体是小分子；b，连接体是肽链。类型II：c，连接体是小分子；d，连接体是肽链）

2、双环肽的合成

天然双环肽所表现出的各种生物活性，极大地激发和鼓舞了药物化学家去合成和探索更多的双环肽，大量的合成双环肽进入到药物研发的市场。1978年，Zanotti等合成了第1个双环七肽，第1步环化在L-半胱氨酸和氧化色氨酸衍生物之间形成分子内硫醚键；然后在混合酸酐中进行第2步环化（头尾相连），得到双环色氨酸七肽和八肽（图式3）。CD谱显示，他们的结构分别类似于蘑菇的生殖器毒素和肉毒杆菌毒素。随着合成技术的发展，越来越多的方法可用于双环肽的合成。

图式3 首例合成双环肽

含有二硫键的肽在自然界中广泛存在，二硫键赋予了良好的热稳定性和水解酶稳定性，以及结构多样性。受此启发，在构建双环肽的方法中，利用半胱氨酸的巯基形成二硫键的方法尤为突出，是人工合成双环肽的常用策略。2001年，Sun等报道了一种合成两亲性双环肽的有效的方法。线性肽分子中包括N端的半胱氨酸（Cys）、C端的硫酯结构以及内部的Cys。第1步环合是N端的Cys和C端的硫酯形成分子内硫酯的结构，然后经过自发的S，N-酰基转移，形成稳定的内酰胺。在pH值为5~6的缓冲水溶液中，DMSO介导第2步环化，末端的Cys与内部Cys形成树脂外的分子内二硫键，构建了第2个环（图式4a）。通过此方法合成了4个双环肽，并成功构建了由内酰胺和分子内二硫键约束的14个氨基酸组成的双环肽库。这些双环肽均表现出两亲肽所期望的性质，例如，优异的水溶性和膜亲和力。二硫键介导的双环肽合成方法已经非常成熟，近期，Rayala等优化了含2个二硫桥的固相合成，并且成功合成了双环肽OL-CTOP。OL-CTOP具有鼻-脑递送能力，经过生物活性测定发现，经鼻给药OL-CTOP能够剂量依赖性地拮抗吗啡的镇痛作用，并防止吗啡引起的呼吸抑制，这为临床上研发吗啡急性中毒的解救剂开辟了新的思路和途径。

图式4 双环肽合成方法示例（a：通过树脂上分子内硫酯连接和树脂外二甲基亚砜介导的二硫键形成的合成方法；b：Trt-StBu策略用于硫醚双环肽的合成；c：Michael加成法合成双环肽；d：3个正交保护基团（Fmoc、Mtt和Tbe）的二氨基二酸法；e：头尾相连构建双环肽；f：烯烃复分解法；g：烯烃、炔烃复分解法相结合）

然而，在体内还原条件下（例如，谷胱甘肽），以及存在二硫键异构酶时，二硫键极易发生结构重排而导致生物活性减弱。为了克服这个问题，人们多采用更稳定的结构来代替二硫桥，例如，硫醚、酰胺、烯烃、三唑和碳氢化合物桥等。替换二硫化物通常可以提高肽的稳定性，并保持其结构和活性。硫醚键由于与二硫键具有相似的结构参数，是最常用的二硫键代替物，合成方法主要有硫醇双烷基化反应、Michael加成、二氨基二酸的固相肽合成等方法。2021年，Zhu等报道了一种新的硫醚键合双环肽的方法（图式4b）。该方法通过使用Trt保护和 S-StBu 保护的Cys来制备双环肽，在完成所有指定氨基酸的组装后，使用88%TFA裂解树脂，从树脂释放肽片段的同时脱除Trt保护基，使一对巯基裸露，通过硫醇双烷基化反应生成单环肽。随后，使用TCEP原位脱除StBu保护基从而使得另一对巯基裸露，再通过硫醇双烷基化实现双环终产物的合成。该方法不仅避免了传统方法去保护的烦琐步骤，而且降低了成本，更重要的是，该方法中2个硫醚键的形成是在溶液中进行的，用高效液相色谱法可以很容易地进行跟踪。

Michael加成是有机合成中常见的一类反应，Elduque等利用分子内Michael加成反应，得到了2种类型的双环肽（图式4c）。该方法通过游离和受保护的马来酰亚胺基团和2个正交保护的Cys组合，可以获得具有分离（2个环被分开，类似眼镜状，肽1）或融合环（2个环有一部分链是共用的，肽2）的双环肽。值得注意的是，该方法采用了2，5-二甲基呋喃保护的马来酰亚胺衍生化肽，环化和马来酰亚胺脱保护可同时发生，产率高，低聚物的形成程度较低。

在硫醚键的合成方法中，基于二氨基二酸的固相肽合成（SPPS）是一种高效且通用的方法，这种方法减少了合成步骤，提高了最终产品的总收率。更重要的是，使用相同的合成策略，许多不同的二氨基二酸可以很容易地结合到肽中，从而可以通过相同的策略合成不同分子结构的二硫模拟物。在这种策略中使用的二氨基二酸包含2个氨基和1个羧基，需要暂时保护。2018年，Wang等开发了一种新的二氨基二酸保护方法（图式4d），含有3个正交保护基团（Fmoc、Mtt和Tbe）。克服了以往重金属污染和与Fmoc化学相容性差的问题，为高效制备肽二硫键模拟物提供了一条实用途径。

与硫醚键合法非常相似的另一种方法，被简称为头尾相连法，Chen等报道了通过头尾相连法构建双环螺旋肽的新模式（图式4e）。该方法得到的是首尾交联的双环八肽，具有首尾交联臂和C端i，i + 4交联臂。具体来说，在线性肽序列中i，i + 3或i，i + 4位置引入一对Cys残基，并通过1，3-二溴甲基苯交联，得到第1个环；将N端和C端的氨基酸进行修饰，然后用1，4-二溴甲基苯连接，以此得到第2个环。通过此策略得到的双环螺旋肽——SHAP-II有较高的蛋白水解酶稳定性，还具有较好的胃癌抑制活性（IC50值为3.8 μg/mL）和较低的毒性。

由于硫醚键的代谢稳定性有限，采用烯烃和烷烃桥来代替硫醚键可进一步提高代谢稳定性。Ghalit等采用烯烃复分解（RCM）（图式4f）合成了一系列抗生素Nisin的双环模拟物，用烯烃和烷烃桥来代替硫醚键，模拟天然抗生素Nisin硫醚共价约束。所得到的Nisin类似物与天然Nisin进行对比，虽然对靶点的亲和力降低，但仍然具有一定的活性，可作为设计基于Nisin的新型肽类抗生素的第一代先导物。Cromm等联合应用正交闭环炔与烯烃复合法（RCAM/RCM），成功地将小GTPase Rab8的单环肽抑制剂进化为双环配体（图式4g）。该双环肽显示了迄今为止报道的对Rab GTPase的最高亲和力。通过这2种方法，可以得到“钉接肽”，提高肽的α螺旋程度，从而提高膜通透性和代谢稳定性。

除了上述方法外，合成双环肽的一种简单方法是用不同的连接剂连接2个单环肽。例如，Mendive等通过分子内钯催化（Pd（OAc）2）的C-H活化过程，制备色氨酸和苯丙氨酸或酪氨酸残基之间共价键连接的独特约束肽。钯催化偶联是合成环肽的有力方法，除此之外，还可以通过在单环肽序列中插入可偶联的基团来构建双环肽，例如点击化学法。在细胞穿透肽（CPPs）中，环肽由于具有较高血清稳定性而具有更大的优势，研究表明，带正电的精氨酸和疏水色氨酸由于其与磷脂膜的相互作用特性，更大程度的提高了细胞穿透能力。Oh等以单环肽为基础，合成了2种由色氨酸和精氨酸残基组成的双环肽。三唑和β-丙氨酸为连接剂的双环肽在人卵巢腺癌细胞中的细胞传递能力提高了7.6倍和19.3倍。而2个母体单环肽[R5]和[WR]4仅能分别提高1.3倍和3.7倍。这种双环肽可以作为一类新的细胞穿透肽和细胞递送工具，在药物递送方面有进一步的应用价值。

传统的双环肽获得方法大多数是使用烷基化试剂对Cys进行修饰，虽然这些方法取得了很大的成功，但这种方法既不是选择性的，也不是生物相容性的。Ullrich等提出了一种肽双环化的新技术，该策略不需要催化剂，具有生物相容性，并正交于所有的典型氨基酸。该策略是基于1，2-氨基硫醇和2，6-二氰吡啶之间的选择性缩合反应，可以直接获得高收率的复杂双环肽。使用此策略，还可以在双环肽的基础上进一步合成三环肽。

近年来，涌现了大量新的合成方法，可用于双环肽的构建。Chen等报道了一种Cys导向的邻近驱动策略，用于从简单的天然肽前体构建双环肽，该方法使用新型氯肟基为交联剂，肽双环化是通过快速的Cys偶联实现的，随后是邻近驱动的分子内酰胺键形成，利用反应速率梯度，实现双环肽的可控合成。该方法反应条件温和，在室温、水相和中性pH条件下可快速完成双环化，具有生物兼容性好、反应速度快和高效的优点。Wu等将双吡啶作为一种新的多功能短链连接剂，合成了各种复杂的双环肽，嵌入的双吡啶可以分别转化为荧光BODIPY染色，在体外作为癌症选择性靶向蛋白成像探针，也可以直接作为选择性金属传感器在水介质中使用。

然而，随着双环肽序列的增加，分子的刚性往往难以维持，特别是对于一些缺乏二级结构和疏水核心的双环肽，这在很大程度上限制了双环肽与靶标结合的亲和力。Lin等发现了一种胱氨酸桥和脯氨酸残基约束的双环肽新支架，该支架具有良好的刚性，双环肽可以通过该支架稳定成有序结构。

3、总结及展望

在双环肽的获取方面，各种合成方法和肽库筛选相结合，获取途径进一步扩大，简便、易得是双环肽的一大优点。含有二硫键的肽在自然界中广泛存在，二硫键赋予了双环肽良好的热稳定性和水解酶稳定性，因此，二硫键介导的双环肽合成是目前常用的策略。基于二硫键的不稳定性，现多采用其他小分子连接物为介导，最常见的有硫醚键、烯烃、炔烃等。小分子介导的双环肽是化学和生物合成双环肽常用的手段，开发结构更稳定、生物相容性更高、毒性更低的小分子连接物是目前双环肽合成领域的热点。除了小分子连接物的介导以外，分子内酰胺键、头尾相连等简便方法也被广泛应用。然而，双环肽合成仍然面临一些挑战，例如，合成效率低、操作烦琐和大规模合成成本高昂等。在未来，开发效率更高、成本更低的合成方法是重要的研究方向。

在双环肽的活性方面，首先，双环肽具有更高的亲和力、稳定性和细胞膜通透性。因此，未来可以将具有一定活性的线性肽、单环肽进行双环化以提高活性和生物利用度；第二，相对于抗体的分子量大、免疫原性等缺点，ADCs的缺点能很好地被双环肽偶联物解决，我们期待双环肽偶联物的成功上市，这一领域也将是未来双环肽靶向治疗的热点。基于双环肽所表现出来的一系列优点，我们大胆推测，在将来，也许双环肽会取代抗体作为治疗、诊断试剂方面的应用。第三，对于小分子药物，一些被认为“不可成药的靶点”，双环肽是可以实现的，这有望靶向一些棘手的靶点，对治疗一些人类尚未解决的疾病存在潜在价值。然而，双环肽仍然存在一些需要进一步克服的缺点。首先，肽类药物的溶解度一直是一个重要的问题，溶解度直接关乎药物的细胞渗透性和生物利用度。虽然目前可以采用制剂的方法解决部分溶解性问题，但想要完全解决这一问题又不影响活性，还需要研究人员进一步的探索。其次，双环肽较线性肽和单环肽的构象刚性增加，与受体结合时熵罚降低，有利于结合靶标。但更大的刚性意味着更低的自由度，这就有可能导致分子与靶点结合时的构象可能处于不利的能量和空间位置，从而导致脱靶现象。最后，虽然部分双环肽对受体具有很高的亲和力，但在活性实验中并没有表示出预期的活性，这是未来双环肽需要攻克的重点。

参考文献：DOI: 10.7536/PC240613,Shuxian Zhang, Kang Jin. Chemically Synthetic Strategies for Bicyclic Peptides and Their Application in Drug Development[J]. Progress in Chemistry, 2025, 37(5): 649-669 DOI: 10.7536/PC240613

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