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要使递送载体具备肽的功能，首先应通过化学策略将肽与递送载体连接起来。为了实现高效且功能理想的连接，有两个重要问题需要考虑，包括（i）所用的末端和连接方式，以及（ii）所采用的肽连接策略。在本节中，我们将展示每种采用方法的实例以进行比较研究，并对这两个关键问题提供见解。

1. 用于肽偶联的末端和连接体

通常，肽的N端或C端均可作为偶联位点，因为肽的末端对其功能影响不大。然而，值得注意的是，半胱氨酸的末端基团常被用作肽的反应性偶联位点，以同时保持肽的功能并提高偶联效率，原因在于：i）许多肽序列中只有一个半胱氨酸残基作为反应位点；ii）药物递送系统（DDS）中的马来酰亚胺基团与肽中半胱氨酸的游离巯基是一对反应性极强的组合，可实现肽偶联药物递送系统。马来酰亚胺与半胱氨酸的迈克尔加成反应因其反应速率快、选择性高以及反应条件温和而易于进行，在肽偶联领域一直占据着特殊地位。

肽的连接位点选择对于保持其活性以及与相应受体的最佳结合至关重要，因为空间位阻会损害其特异性识别。Meneghetti设计的AuNP-PEG-KKKGG-GE11C就是一个显著的例子，其中肽的N端通过由三个赖氨酸和两个甘氨酸组成的阳离子间隔基与PEG链相连。结果表明，AuNP-PEG-KKKGG-GE11C对Caca-2和SEW480细胞系（EGFR+）的敏感性明显高于其他修饰的金纳米粒子。

通常，肽偶联药物递送系统由功能性肽、递送载体以及两者之间的连接部分组成。因此，用于连接的键合类型的选择对于肽与递送载体之间的连接对于肽修饰递送系统最终的性质和性能至关重要，甚至会产生显著影响。。已报道用于肽偶联的连接基团主要包括硫醚、酰胺、二硫键和1,2,3-三唑等。值得注意的是，生物材料中广泛存在的羧基为肽偶联提供了可靠的方法，因为羧基与各种功能基团具有很高的反应活性，例如NH2-PEG-Mal、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、11-叠氮基-三氧杂十一烷-1-胺和2-（2-（吡啶-2-基）-二硫基）-乙醇。

2. 用于肽偶联的化学方法

将肽与药物递送系统（DDSs）进行偶联时，应首先在温和的反应条件下进行，以避免在苛刻环境中造成偶联肽功能的丧失。此外，偶联肽的量应足以使药物递送系统发挥肽的预期功能，即通过所采用的化学方法获得良好的肽偶联效率。考虑到肽结构中存在高反应性的胺、羧基和巯基，所采用的偶联方法（方案1）包括缩合反应、硫醇-二硫键交换、点击反应和迈克尔加成，其中马来酰亚胺-巯基之间的迈克尔加成是最常用的。表 1 总结并比较了已报道的三种主要的肽偶联策略。

方案1. 常见共轭策略的示意图：通过（a）在 N 端修饰半胱氨酸的迈克尔加成反应，（b）在 C 端修饰半胱氨酸的二硫交换反应，（d）通过氨基的酰胺化反应，以及（e）在 C 端修饰炔基的点击化学反应。

通常会在肽序列的N端或C端引入具有游离巯基的半胱氨酸，以便后续将肽与药物递送系统（DDSs）进行偶联。由于反应活性高且反应条件温和，马来酰亚胺是与肽上的活性巯基通过迈克尔加成反应进行化学偶联的高活性亲电试剂。在pH值约为7.0的条件下，巯基对马来酰亚胺的亲核加成反应活性远高于氨基。报道的一般实验步骤简述如下：将马来酰亚胺修饰的材料分散在pH值约为7.0的缓冲溶液中，如HEPES和PBS缓冲液。将末端为半胱氨酸的肽与材料溶液简单混合，在氮气保护下于室温下搅拌一定时间进行偶联。报道的偶联效率在40%至75%之间。例如，半胱氨酸修饰的NGR基序肽（序列CYGGRGNG，为氨肽酶的配体）通过迈克尔加成反应与1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-马来酰亚胺（聚乙二醇）（DSPE-PEG2000-Mal）偶联，用于肿瘤特异性治疗。

除了应用最广泛的马来酰亚胺 - 硫醇反应外，还采用了其他偶联反应将肽与药物递送系统（DDSs）连接起来，例如酰胺化反应和点击偶联反应。

基于铜催化的炔烃-叠氮环加成（CuAAC）反应的点击偶联是一种高效的替代方法，可替代马来酰亚胺-硫醇之间的迈克尔加成反应用于肽偶联。因此，肽和药物递送系统（DDS）应分别预先修饰上活性炔基或叠氮基团，以便后续进行CuAAC点击偶联，在肽和DDS之间形成1,3-三唑环连接。由于该反应具有高效性、形成的三唑功能基团稳定性好、对其他官能团具有显著的正交性以及叠氮基和炔基标签易于获得等优点，该反应已被广泛应用于肽偶联。然而，由于所用的铜催化量需要额外的纯化步骤，因此最近开发了无铜点击偶联作为肽点击偶联的更环保替代方案。值得注意的是，应变促进的叠氮-炔烃环加成（SPAAC）点击反应，也称为无铜点击反应，依赖于从弯曲的三键到双键转变过程中释放的环张力，这避免了使用铜离子作为催化剂，从而降低了体内生物毒性。

此外，硫醇-二硫键交换可用于在还原剂（如 D,L-二硫苏糖醇（DTT））存在的情况下，将半胱氨酸修饰的肽通过二硫键连接到载体上。根据该机制，环 RGD（cRGD）（环（R-G-D-f-C））肽被修饰到含有吡啶二硫键单元的纳米凝胶表面，这结合了封装稳定性和靶向能力。

最后但同样重要的是，基于 EDC/NHS 偶联的酰胺化反应通常缺乏选择性，这是由于肽中存在大量的胺基和羧基。一般来说，奥曲肽（一种内源性生长抑素的八肽类似物）通过活性 NHS 基团与 NHS 修饰的载体材料（如聚乙二醇 - 嵌段聚己内酯 (ε-caprolactone)（PEG-b-PCL））偶联，为肿瘤治疗提供了策略。因此，这种方法可能会导致期望的肽结构发生扭曲，因此不被视为首选的偶联策略。

3. 肽偶联效率的量化

肽的偶联效率显著影响用于癌症治疗的肽偶联药物递送系统（肽-DDSs）的功能和稳定性。偶联不足通常会导致偶联肽的功能受损，这显然不利于有效的癌症治疗。相反，过度偶联可能会改变DDSs的盐稳定性和血清稳定性，并导致DDSs与非靶细胞和其他生物活性物质发生非特异性相互作用。因此，精确量化和调节偶联效率对于保证制备出具有所需功能和性能的用于抗癌药物递送的肽-DDSs至关重要。已报道的用于表征肽偶联的分析技术主要包括傅里叶变换红外光谱分析、1H核磁共振光谱和紫外吸收分光光度法。例如，在1H核磁共振谱中，马来酰亚胺基团双键质子在6.70ppm处的特征共振信号的积分强度在马来酰亚胺-硫醇迈克尔加成反应前后的变化可用于定量肽偶联效率。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析能够为肽与药物递送系统（DDS）之间形成共价键提供定性证据，但不包括肽或DDS结构中已存在的键，如酰胺键。一个典型的例子是Stepensky合成的肽偶联量子点，其通过叠氮化物修饰的量子点与末端为炔基的肽之间的点击偶联反应实现。叠氮化物功能化的量子点在2100cm−1处显示出明显的叠氮化物特征FT-IR吸收峰，而在肽-量子点偶联物的光谱中，该峰几乎消失，这是由于叠氮化物用于肽偶联而被消耗。然而，值得注意的是，FT-IR分析不适合定量测定肽偶联效率，部分原因是特征FT-IR信号重叠，难以识别。

除了常用的1H核磁共振（1HNMR）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）测量外，用于表征肽偶联效率的其他报道的分析工具还包括高效液相色谱（HPLC）、BCA蛋白质检测试剂盒、元素分析仪等。例如，高效液相色谱分析能够以极高的选择性、灵敏度和重现性测定任何未偶联肽的浓度。结合材料浓度的定量，可获得药物递送系统（DDS）上偶联肽的平均表面密度。除了高效液相色谱法，BCA蛋白质检测试剂盒法还可以通过将肽修饰的纳米颗粒和未修饰的纳米颗粒作为样品直接检测偶联肽的量。肽与碱性铜离子（Cu2+）之间有文献记载的BCA反应会形成一种强烈的紫色复合物，该复合物可用于根据游离肽的标准工作曲线来测定结合肽的浓度。例如，将20毫升肽结合纳米颗粒和不含肽的纳米颗粒的等分试样分别加入96孔板中，然后加入BCA蛋白质测定试剂。在37℃下孵育1小时后，用酶标仪在562纳米处测量吸光度，以定量测定肽结合效率。BCA测定法因其高灵敏度、快速、可靠、操作简单以及适用于多种肽类而被广泛使用。然而，与高效液相色谱法相比，该测定法更容易受到温度、反应时间和无菌条件的影响。最后但同样重要的是，氨基酸分析（AAA）是一种成熟的方法，能够提供肽中每种氨基酸绝对量的准确和定量测量。

由于大多数氨基酸本身没有特征吸收，除了芳香族氨基酸外，因此在进行氨基酸绝对定量分析之前，应对这些氨基酸进行衍生化处理。实际上，定量测量是通过氨基酸的色谱分离，然后测定每个残基的量来实现的。在Di及其同事的研究中，通过UPLC氨基酸分析法对REG肽与纳米粒子的结合进行了定量测定。WatersUPLC氨基酸分析试剂盒基于一种用于氨基酸绝对定量分析的衍生化试剂。氨基酸定量需要通过内标法获得校准标准品。然而，与其它分析工具相比，氨基酸绝对定量分析通常存在分析时间长、成本高以及样品预处理复杂的问题。

需要注意的是，共轭肽可能会影响亲本药物递送系统的稳定性。通常，已报道的肽共轭药物递送系统与前体药物递送系统相比，胶体稳定性几乎相同，只是由于肽的共轭作用，平均粒径和多分散指数（PDI）略有增加。

4. 载体在肽功能化递送载体中的作用

载体的结构差异在肽功能化递送载体的性质和性能方面也起着重要作用，因此，以下简要讨论了四种常用于肽功能化的主要载体类型。

聚合物胶束：聚合物胶束是由两亲性共聚物自组装而成的具有核壳结构的胶体粒子。疏水性核心可用作封装在水相中溶解度差的疏水性药物的容器，而亲水性外壳则可保护核心并稳定自组装的颗粒。聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA）作为一种典型的两亲性嵌段共聚物，其亲水性聚乙二醇（PEG）段可通过迈克尔加成或酰胺化偶联反应修饰特定的功能肽。通过溶剂蒸发法，以1:9的摩尔比制备了肽偶联的PEG-PLA（NGR-PEG-PLA）和mPEG-PLA的胶束复合物，用于负载疏水性药物多西他赛（DTX）。有趣的是，据报道肽修饰对自组装聚合物胶束的粒径、Zeta电位和稳定性影响不大。

脂质体：脂质纳米颗粒是首个从实验室走向临床应用的纳米级药物递送载体，因而逐渐成为一种受欢迎的纳米平台，具有免疫原性低、生物降解性好和细胞毒性可忽略不计等优点。由于脂质独特的双层结构，疏水性和亲水性物质可通过疏水作用和氢键同时被包裹在脂质体中。聚乙二醇化已被报道是一种提高脂质体稳定性、循环时间和治疗效果的有效策略。例如，聚乙二醇化将脂质体的血液循环半衰期从0.5小时延长至5小时。功能肽可通过柔性聚乙二醇间隔基进一步与脂质体连接。所得的GE11共轭罗丹明标记脂质体（GE11-TLs）由6.4μmol/mL氢化大豆磷脂酰胆碱（HSPC）、2.94mol/mL胆固醇、0.40μmol/mLDSPE-PEG和0.20μmol/mLDSPE-PEG-GE11组成。聚乙二醇层过高的表面密度可能在一定程度上影响脂质体的理化性质。

树枝状大分子：树枝状大分子（例如PAMAM）是一种具有明确结构和单一尺寸分散性的支化聚合物，其表面的化学基团可进一步进行化学修饰。治疗性分子不仅可被封装在树枝状大分子的内核中，还可通过共价键或非共价相互作用结合在其外围。然而，PAMAM在生理pH值下的正电荷限制了其应用，因为存在溶血毒性和血清蛋白吸附等问题。

聚乙二醇化能够有效降低PAMAM的血液毒性并提高其生物相容性，其原理在于降低PAMAM的表面电位。Liu及其同事证明，PEG与PAMAM分子表面胺基单元的摩尔比为15%的PEG-PAMAM不会导致溶血，并且在293A细胞中的细胞存活率（81.9%）高于PAMAM（57.3%）。进一步对肽进行修饰并未改变PEG-PAMAM的特性。

介孔二氧化硅纳米粒子（MSNs）：MSNs 作为极具前景的纳米平台，因其可定制的介孔结构和高比表面积等显著优势，在生物医学研究中备受关注。通过用各种功能肽修饰 MSNs，为制备具有巨大癌症治疗潜力的多功能纳米载体提供了无限可能。

参考文献：doi.org/10.1016/j.ijpharm.2020.120141