此外，比伐卢定是一种从水蛭素结构简化而来的肽类抗凝血药物，由医药公司研发（表 1），于 2000 年 12 月获得美国食品药品监督管理局批准上市，主要用于不稳定型心绞痛的经皮冠状动脉腔内成形术和经皮冠状动脉介入治疗。然而，作为一种肽类药物，比伐卢定的暴露量（AUC0-t = 23.7 纳摩尔·分钟/毫升）较低，半衰期（t1/2 = 15.1 分钟）较短，药代动力学特性不尽如人意。为了克服这些缺点，研究人员通过脂化策略对比伐卢定类似物 73 进行了化学修饰。对比两种比伐卢定类似物 73 和 74 发现，它们的药理活性基本保持不变，但经脂肪酸修饰的肽 74 与未修饰的肽 73 相比，暴露量（AUC0-t = 1371.7 纳摩尔·分钟/毫升）和半衰期（t1/2 = 212.2 分钟）显著增加，暴露量和半衰期分别增加了 58 倍和 14 倍（表 1）。

利拉鲁肽、司美格鲁肽和替西帕肽这三种已成功上市的降糖肽类药物，均引入了源自天然胰高血糖素样肽-1（GLP-1）的脂化修饰。引入脂肪酸增强了药物的疏水性，掩盖了二肽基肽酶-4 的结合位点，减少了肾脏排泄，从而延长了药物的半衰期（图 3）。利拉鲁肽是诺和诺德公司的一种长效 GLP-1 受体激动剂，在注射部位可形成稳定的七聚体，有效掩盖了二肽基肽酶-4 的结合位点，并与血清白蛋白形成可逆复合物。这显著延长了利拉鲁肽在体内的吸收时间，并延长了肽类药物的半衰期。此外，司美格鲁肽通过谷氨酸作为连接体，在第 26 位赖氨酸的侧链上引入十八碳酸，增强了其疏水性，并显著延长了其半衰期至一周。再者，在替西帕肽中，C20 脂肪二酸基团通过γ-谷氨酸连接体与肽主链相连。这种结构上的改变显著提高了药物的稳定性和生物利用度，同时减少了其在体内的快速代谢。

尽管脂化已被证明能提高肽类药物的生物活性和理化特性，但这种修饰也可能增加肽与各种生物膜的亲和力。因此，肽类药物的脂化可能会导致膜或靶蛋白特异性的降低以及溶血率的升高。不过，这一缺点可以通过将脂化与其他化学修饰技术相结合来有效克服。

PEGylation

聚乙二醇（PEG）作为一种活性药物聚合物，具有惰性、高水溶性以及在极性和非极性溶剂中的高溶解性等特点。PEG的结构可以是线性、支链或多臂型，将PEG连接到治疗剂上的过程称为“聚乙二醇化”，这依赖于分子量的适当选择以及用于连接目标分子的化学键。此外，PEG在体内具有可降解性和低毒性，因此常用于修饰肽类药物以增强其性能和生物活性。PEG通常连接到肽类药物上，能带来诸多益处，如延长血清半衰期、提高水溶性、增强稳定性、生物相容性。聚乙二醇化还能增加肽类药物的分子量和水动力学半径，从而减少肾脏的肾小球滤过。

目前市场上有多种聚乙二醇（PEG）修饰的肽类药物，其中聚乙二醇化干扰素α是这种结构修饰策略的成功范例（图 4）。干扰素α能够有效抑制或清除乙型或丙型肝炎病毒，但作为肽类药物，它存在易被酶降解、半衰期短以及需要频繁注射等缺点。为解决这些问题，先灵葆雅研究所在干扰素α中引入聚乙二醇，增大了分子的大小，降低了被肾脏滤过的可能性，从而延长了半衰期。然而，聚乙二醇化可能会降低肽与靶蛋白的结合能力，从而影响其治疗效果。因此，聚乙二醇化干扰素α可能会因引入聚乙二醇而减少受体结合，从而降低干扰素α的抗病毒活性。为应对这一问题，先灵葆雅研究所对聚乙二醇的大小进行了深入研究，最终确定使用 12 千道尔顿的聚乙二醇能够在最大程度上延长半衰期的同时保持干扰素α的抗病毒活性。
聚乙二醇化也是一种有效的策略，能够降低细胞毒性、溶血作用，并提高活性。据报道，通过在一种创新复合肽（CaLL，由抗菌肽 Cecropin A 片段和 LL-37 组成）的 N 端进行聚乙二醇化，得到了 PEG-CaLL（图 5A），这种肽能够保护自身免受血清降解，降低溶血毒性，并增强对肺部感染的治疗效果。此外，在大鼠肺模型实验中，PEG-CaLL 并未破坏肺上皮的完整性，表明其在治疗细菌性肺炎方面具有潜在的安全性。另外，Kim 等人采用模块化方法设计了具有聚乙二醇主链的肽序列，称为 PEGtides。这些序列表现出强大的杀菌作用和细胞特异性，从而提高了肽类药物的治疗指数，并展示了一种创新的肽模拟聚乙二醇化修饰策略（图 5B）。

此外，尽管聚乙二醇化能够降低细胞毒性和溶血作用，但也会降低肽与生物膜和细胞内靶点的亲和力，从而降低其生物活性。这种现象可能是由于聚乙二醇分子造成的空间位阻，改变了肽的结构，破坏了其与生物膜和细胞内靶点的结合，从而削弱了其生物效应。例如，与天然肽相比，聚乙二醇化后的鲎素和蛙皮素细胞毒性显著降低，对大肠杆菌和表皮葡萄球菌的效力也有所减弱。此外，马尔姆斯滕及其同事还证实，抗菌肽 KYE28 的聚乙二醇化导致其抗菌效力降低，这种效应与聚乙二醇链的长度有关。不过，聚乙二醇化的肽类药物与细菌和血细胞混合时，溶血毒性显著降低，对细菌的选择性增强。因此，在采用聚乙二醇化修饰策略时，必须仔细权衡肽类药物的半衰期、选择性、细胞毒性和活性之间的关系。

环化

环化是一种常用于肽类药物的简便修饰技术，可为肽模拟物和线性肽带来一系列有利特性，包括提高靶点选择性和特异性、增强细胞通透性以及提高稳定性。由于环肽具有固定的几何形状，降低了与靶点结合的熵成本，因此能够更有效地、更有选择性地与靶点结合。相比之下，线性肽由于其高度的构象灵活性，可能会导致非特异性和脱靶相互作用，从而增加不良副作用的风险。环化策略包括主链-主链环化、侧链-主链环化和侧链-侧链环化（图 6）。肽类药物的环化可提高蛋白水解稳定性、细胞通透性，并有效固定肽的二级结构。通常，单个肽序列自身无法形成转角或环状结构，但环化策略通过预先组织肽分子内的相互作用来促进二级结构的形成。因此，肽环化也是稳定二级结构（包括β-折叠和α-螺旋）的一种常见策略。

环肽在治疗学中的应用日益广泛，用于调节蛋白质-蛋白质相互作用、诊断、酶抑制、成像以及 RNA 结合，这导致了肽类药物开发中环化策略应用呈指数级增长的趋势。大量研究表明，环肽通常具有出色的物理化学性质和活性，这得益于其对蛋白水解的抗性增强以及构象刚性的提高。此外，环化还能增强细胞选择性，从而降低对宿主细胞的毒性。最近，设计、合成和评估环肽的各种创新方法不断涌现。受天然环状防御素分子内半胱氨酸二硫键的启发，Lai 及其同事成功开发了一种通过二硫键形成的环状抗菌肽。他们向从蛇毒中提取的肽类物质 cathelicidin-BF15-a3 中引入了两个半胱氨酸残基，所得环肽对铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌表现出良好的活性，溶血作用极小，稳定性增强，且不易产生耐药性。汉考克及其同事研究了不同环化方法对线性肽 IDR-1018 抗菌、抗生物膜和免疫调节活性的影响。所采用的环化方法包括头尾环化、谷氨酸羧基与 N 端氨基环化以及通过在肽两端引入半胱氨酸形成二硫键环化。在这三种环化方法中，侧链尾部环化产生的大环肽在小鼠皮肤感染模型中表现出强大的抗炎能力，并显著减少了细菌数量。此外，费特塞等人通过大环化筛选方法发现了能够通过抑制 PD-1/PD-L1 相互作用发挥抗肿瘤作用的环肽。与母肽相比，环状衍生物的 PD-L1 阻断活性提高了 34 倍，血清稳定性提高了 4 倍。该研究表明，大环化筛选是肽类药物开发中的一项宝贵技术，尤其是在肽受体相互作用的结构细节匮乏的情况下。

α-螺旋是许多肽类药物常见的二级结构特征，但合成肽在水溶液中往往难以维持稳定的α-螺旋结构。这种不稳定性增加了肽水解的可能性，削弱了与靶点的结合能力，从而导致肽的稳定性和生物活性降低。为解决这一问题，研究人员开发了多种限制主链的方法来保持肽的α-螺旋构象。通过这些方法获得的肽被称为“环肽”，本质上是一种环化修饰策略（图 7A）。ALRN-6924（图 7B）是通过全碳环化方法获得的一种环肽，是 MDM2/MDMX 拮抗剂的典型代表。目前，拮抗剂 ALRN-6924 已进入二期临床试验，有望用于治疗晚期淋巴瘤和实体瘤。为了增强肽 PDI 的药效学和药代动力学，Pentelute 等人采用了赖氨酸 N-芳香化环化策略，在 i 和 i + 7 位置添加了两个赖氨酸残基，保留了 PDI 的关键残基，并合成了全氟芳香化环肽。图 7C 所示的环肽 SPDI-14 具有更高的酶稳定性，与线性肽相比，其与目标蛋白的结合效果更佳。此外，与未环化的肽相比，SPDI-14 与目标蛋白的结合效果更佳。

总体而言，肽环化策略在提高肽类药物的稳定性、细胞通透性、靶点亲和力、生物利用度和疗效方面展现出显著优势，这标志着肽类药物开发的一个重要趋势。随着合成技术的不断进步以及创新策略的涌现，未来有望开发出更多有效的环肽类药物，以满足各种疾病治疗的广泛需求。

糖基化

蛋白质的糖基化是一种关键的翻译后修饰，极大地丰富了蛋白质结构和功能的多样性。糖链通过共价键连接到蛋白质或肽的不同氨基酸残基上，根据连接方式的不同，可分为四种类型：O-糖基化（连接到苏氨酸、丝氨酸或酪氨酸）、N-糖基化（连接到天冬酰胺）、C-糖基化（连接到色氨酸）和S-糖基化（连接到半胱氨酸）（图 8）。糖链的存在展现出一系列有利的生理和生物学特性，包括有助于蛋白质折叠、促进蛋白质识别、增强免疫反应以及提高靶点特异性，从而增强肽类药物的生物活性。此外，特定氨基酸位置的糖基化会影响肽类药物的立体化学、刚性和活性。同时，糖基化的性质还取决于糖肽键相互作用的特性，并且可以根据糖苷键、寡糖成分、链长和整体结构进一步变化。因此，糖基化策略被广泛认为是一种极具前景的方法，能够增加肽的亲水性，提高生物利用度，调节并稳定肽的构象，增强其抗蛋白水解的能力。

O-糖基化是一种在各类生物体中普遍存在的一种翻译后修饰形式。通过共价键将糖基部分连接到肽链中的丝氨酸或苏氨酸残基上，可以形成一系列 O-糖基化肽，从而增强其生物活性。O-糖基化肽的类型包括黏蛋白型 O-糖基化（连接 N-乙酰半乳糖胺 GalNAc）、O-葡萄糖基化、O-岩藻糖基化和 O-甘露糖基化。一些研究小组发现，从肠杆菌素 F4-9 中去除糖基化部分会导致其抗菌活性完全丧失。鉴于色氨酸对溶血活性有显著影响，Kaur 等人设计了一种吲哚衍生物，并用 O-糖基化苏氨酸取代芳香族氨基酸，从而降低了对哺乳动物细胞的细胞毒性，同时提高了治疗选择性。糖的存在限制了 O-糖基化吲哚的构象灵活性，并促进了其在胶束环境中的相互作用。此外，吲哚的糖基化并未改变肽的机制、细胞因子抑制作用和脂多糖结合能力，但降低了其对红细胞和巨噬细胞的毒性。肽类药物中的 O-糖基化通常还能提高肽的稳定性。吴等人（2020 年）使用了 12 种单糖的 O-糖基化策略，以研究其对肽的物理化学性质和抗肿瘤活性的影响。他们发现，几种 O-糖基化肽能够提高酶稳定性、细胞选择性，并增强肽的抗肿瘤活性。目前报道的 O-糖基化肽表明，糖基部分不仅能提高稳定性和生物活性，还有助于受体识别且不会破坏膜结构。此外，糖基部分的氨基和适度的亲脂性对于肽类药物的活性也至关重要。

天然 N-糖苷主要连接在天冬酰胺的侧链上，通常出现在体内天冬酰胺 - 任意氨基酸 - 丝氨酸/苏氨酸的三肽序列中。化学合成的 N-糖基化肽通常在肽组装过程中包含一个或多个糖基化氨基酸作为合成单元。郭等人利用容易获得的苯基保护的 N-糖基化氨基酸，直接将其纳入固相肽合成中，从而生成天冬酰胺侧链上连接有单糖、双糖或乳糖的曲洛西丁 A 类似物。他们发现直接连接糖基会影响曲洛西丁 A 的构象和生物活性，而糖基与天冬酰胺之间短的连接基团能够保持其有效的生物活性，从而生成更有效的新型 N-糖基化肽。胡及其同事进一步通过将各种单糖和双糖连接到短连接基团上，扩展了 N-糖基化曲洛西丁 A 类似物。通过引入 N-糖基化氨基酸，他们合成了对耐万古霉素肠球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有强效抗菌作用的 N-糖基化曲洛西啶 A。他们的研究表明，曲洛西啶 A 与α-糖苷之间较短的连接基对其效力有积极影响，而较长的连接基则可能对β-糖苷有利。Chan-Park 等人利用聚合物化学技术将聚-L-赖氨酸与壳聚糖结合，通过 N-羧基酐开环聚合生成一系列阳离子壳聚糖-聚-L-赖氨酸（CS-g-Kn），对革兰氏阴性菌表现出显著的抗菌效果。糖基化肽对真菌和细菌的细胞壁成分具有结构亲和力，从而具有很强的膜通透性和膜破坏能力。

S-糖基化肽作为 O-糖苷的硫醇连接类似物，已在人类尿液中被发现。S-糖苷在化学和酶促方面都表现出稳定性，使其成为 O-糖苷的合理结构替代品，而且其更高的灵活性有助于维持肽药物的生物活性。《自然》杂志报道了几种含 S-糖基化的糖基化肽，包括糖辛 F、ASM1 和瑟兰汀 A/B。此外，Donk 等人发现 S-糖基化亚兰辛类似物，包括半乳糖基化、甘露糖基化和 N-乙酰葡糖胺基化，表现出与天然 S-糖基化亚兰辛相似的抗菌活性，并且活性优于非糖基化类似物。阳离子多糖肽与肽聚糖类似，对微生物具有高度选择性，但其合成涉及多种化学合成或重金属催化剂。为避免使用铜催化剂，李及其同事通过无铜硫醇-烯“点击”化学将各种抗菌肽与三种不同的生物相容性壳聚糖结合。这种方法以环境友好且低毒的方式获得了几种多糖糖基化肽，将抗菌活性扩展到了抗真菌活性。早期关于酶促 S-糖基化肽药物的构效关系研究表明，糖基化是生物活性的必要条件，但己糖部分的立体化学并非关键所在。此外，用 S-连接的 GlcNAc 替代 O-GlcNAc 可增强杀菌活性，为设计更有效的抗生素肽提供了思路。对糖肽素 F 作用机制的详细研究表明，S-糖基化部分有助于肽药物靶向膜靶点。与 O-/N-糖基化肽相比，S-糖基化肽对细胞外和细菌糖苷酶及转糖苷酶的稳定性更高，随着合成 S-糖基化氨基酸和酶促 S-糖基化最新进展的出现，S-糖基化肽药物的修饰和优化范围将大大扩展。

除了将糖基化氨基酸整合到肽序列中，碳水化合物基团也可以选择性地与肽序列偶联。维尔利等人利用成熟的铜（I）催化叠氮化物 - 炔烃环加成（CuAAc）反应开发出了更高效的抗真菌肽。他们通过三唑连接子将单糖片段偶联到已知的抗菌肽 hylaseptin-P1 上，所得的糖肽表现出更高的生物活性，包括更强的膜相互作用和膜破坏能力。此外，戈麦斯及其同事通过铜促进的点击化学反应将含精氨酸的抗菌肽 Dhvar-5 与壳聚糖共价连接，这种肽固定在多糖化合物表面，抑制细菌附着并导致细菌死亡。与其他糖基化修饰一样，C-糖基化修饰有助于肽药物更有效地与靶点相互作用，并将对哺乳动物细胞的毒性降至最低。利用生物偶联化学技术对糖基进行修饰，能够进一步提升针对病原体的有效抗菌肽的实用性和进化性。

糖基化是一种极具前景的工具，它不仅能增强药物的生物活性，还能保持其特定构象，这对于立体特异性受体识别至关重要。化学糖基化还能改变肽类药物的物理化学特性，克服糖苷酶耐药性相关难题，并通过非天然修饰增强治疗应用。作为蛋白酶稳定的药物，化学糖肽已在肿瘤学、疫苗开发和抗冻蛋白的制备等多个领域得到开发。重要的是，化学糖基化不仅能产生更有效的抗病原体肽，还有助于稳定肽类构象以利于受体识别，提高肽类对各种酶水解的稳定性，并且每次都能独特地影响肽类药物的序列。

其他策略

除了上述化学修饰策略外，诸如 N-甲基化、侧链卤化和胍基化等其他方法在肽类药物开发中也取得了重大进展。这些方法对于提高肽类药物的稳定性、生物利用度和生物效应至关重要，并展现出广阔的应用前景。

肽酰胺键中的氮原子烷基化是一种关键的化学修饰手段，能够显著提升治疗性肽的成药性和药代动力学特性，包括吸收、半衰期和生物利用度。在众多 N-烷基化技术中，N-甲基化由于其通用性和合成便利性而被最频繁地使用。N-甲基化修饰通过增加空间位阻来提高肽药物的稳定性，促使肽链倾向于采取顺式构象。例如，McBrayer 等人（2019 年）证实，N-甲基化能大幅增强肽对蛋白水解的抗性，使粪肠球菌群体感应调节肽的半衰期延长了六倍多。另一项研究评估了 N-甲基化肽抑制剂对中性内肽酶、氨肽酶 N 和血管紧张素转换酶的活性，这些酶在它们的天然底物中。结果表明，N-甲基化使肽衍生物表现出更强的抗高血压、抗心肌肥厚和抗纤维化活性。

卤化是一种新兴的技术，用于调节有机化合物（包括肽类药物）的药理活性。在卤素中，氟、碘、氯和溴常被整合到药物分子中以增强其生物活性。特别是氯和氟在药物研发中得到了广泛应用。卤化通常与提高靶点特异性、改善细胞膜通透性以及减少副作用相关。例如，在 RGD 肽中引入卤化色氨酸可增强其对整合素αvβ3 的特异性和结合亲和力。同样，Molchanova 等人（2020 年）研究了不同卤素对肽类抗菌活性的影响，发现氯或溴取代的肽能增强对革兰氏阳性菌的抗菌效果，而氟化作用影响不大。尽管卤化能赋予肽类药物有益的特性，但用卤素取代极性基团可能会增加肽的疏水性，从而可能导致肽类药物聚集并丧失活性。

在胍基化修饰中，季铵基团本身并不直接参与靶点抑制，但因其显著的物理性质和高达 13.8 的 pKa 值而发挥作用。此外，带正电荷的离子化胍基团可通过氢键与磷酸基团形成强相互作用，这一机制进一步增强了胍基化肽的抗菌效果。霍夫曼及其同事设计了一种含 N,N,N'，N'-四甲基胍的抗菌肽，其正电荷在同类物质中最为显著，显著增强了抗菌活性，对革兰氏阴性菌表现出有效的抗菌作用。

与其他技术相比，上述这些修饰方法尽管在肽类药物开发中尚未得到广泛应用，但有望成为未来肽类工程研究中对抗各种疾病的工具包的一部分。这些策略通过增强肽类药物的稳定性、生物利用度和生物活性，为新治疗药物的开发开辟了更多可能性。随着研究的不断深入和技术的进步，预计这些策略在肽类药物领域将得到更广泛的应用。

参考文献：doi.org/10.1007/s00726-025-03454-5