1 空气氧化法
空气氧化法形成二硫键是多肽合成最经典的方法。一般方法是:将脱保护游离出半胱氨酸巯基的多肽溶于水中,在近中性或弱碱性条件下(pH值6.5～10),采用空气自然氧化,反应时间一般需要24小时以上。具体反应条件需在实验中探索。采用空气氧化法须将多肽控制在极稀的浓度下进行,以减少分子间聚合,反应得到热力学控制产物。此方法的优是:副产物为水,纯化方便。其改良的方法是采用二硫键的交换法,如以氧化型谷胱甘肽或氧化型二硫苏糖醇氧化多肽中的半胱氨酸形成二硫键,这是一种二硫键的交换反应,反应速度比空气氧化进行得快,但仍是一种平衡反应,氧化难以进行彻底。在碱性溶液中难溶的富含精氨酸的肽或疏水性较强的肽以及在碱性溶液中易被破坏的肽,不宜采用空气氧化法 ,应采用较强的氧化剂,如碘、铁氰化钾、三氟乙酸铊等进行氧化。
2 铁氰化钾氧化法
铁氰化钾氧化法一般采用的方法是:将脱保护游离出半胱氨酸巯基的多肽溶于水中,用氨水调pH值至7～8,滴加铁氰化钾水溶液(2～4mol·L-1),室温反应60分钟左右,再滴加乙酸调pH值至弱酸性以终止氧化反应。此方法的优点是:将多肽浓度控制在较稀的情况下可以最大限度地避免分子之间形成二硫键。此法的不足之处是纯化较复杂。
3 碘氧化法
碘氧化法一般采用的方法是:将多肽溶于25%的甲醇水溶液或30%的乙酸水溶液中,滴加10～15 mol·L-1的碘进行氧化,反应15～40分钟。由于Tyr、Trp、Met和His对碘很敏感,在氧化过程中应注意控制条件,氧化完毕后,应立即加入维生素C或硫代硫酸钠除去过量的碘。因此,对于含有上述残基的多肽,在采用碘氧化时宜特别小心。
碘可以直接将含有Cys(Acm)和Cys(Trt)的肽氧化形成二硫键 ,但是对于含Cys(tBu)、Cys(4-MeBzl)和Cys(4-MeOBzl)的肽则不能直接氧化。
4 三氟乙酸铊氧化法
Fujii等发现三氟乙酸铊对硫原子有很强的亲合力,它在三氟乙酸中起弱酸和氧化剂的作用,能首先脱除Cys (tBu)、Cys(Ad)、Cys (Acm)、Cys (Trt)的保护基,然后氧化形成二硫键。一般采用1.0～1.2 mol·L-1三氟乙酸铊的三氟乙酸溶液进行氧化,冰浴中反应1小时。在氧化过程中,应加入甘油或茴香醚清除产生的碳正离子。此法对肽链中的His和Tyr无影响,但Met和Trp应事先保护为Met(O)和Trp(Mts),反应后,可用NH4I将Met(O)还原为Met,可用TMSOTf/TFA脱除Trp(Mts)的Mts保护基。此法的优点是:以三氟乙酸作溶剂能解所有的多肽,Tl3+溶于乙醚,易于用乙醚提取除去,从而使肽中不含Tl3+。但用三氟乙酸铊不能脱除并氧化Cys(Bzl),且对Cys(4-MeBzl)的氧化有副反应。
5 二甲亚砜(DMSO)氧化法
二甲亚砜是一种温和的氧化剂。研究表明,二甲亚砜的存在有利于多肽的反向转折,从而有利于二硫键的形成。此法的副产物为易挥发的CH3SCH3和水,因此纯化方便,产率较高。氧化反应可在三氟乙酸和水中进行。

5.1 采用三氟乙酸作溶剂
采用10%DMSO/TFA可在脱除侧链保护基的同时氧化含有Cys(Trt)、Cys (4-MeOBzl)、Cys(Dbs)和Cys(Bzh)的多肽形成二硫键。对含后三种Cys侧链保护基的多肽,一般在25℃反应12小时即完成脱保护及氧化。在相同条件下,对含Cys(Ad)和Cys(4-MeBzl)的多肽,不能采用此法氧化。被氧化多肽链中的,Trp需要进行保护,Met可能部分被氧化成Met(O)。对于含Cys(Trt)或游离出半胱氨酸巯基的多肽,氧化反应可在1小时内完成。
5.2 采用水作溶剂
DMSO可以与水混溶形成混合溶剂。通常用20%DMSO水溶液氧化速度比较合适,反应需1～4小时。此反应可在较大pH值(3～8)范围内进行,对碱性或疏水性强的肽尤其适合。此法对Met、Trp和Tyr无影响。
6 氯硅烷-亚砜氧化法
Numata等报道同时采用三甲基氯硅烷和亚砜可以将苯硫酚氧化成二苯基二硫化物,同时亚砜被还原成硫醚。Akaji等又发现用三氯甲基硅烷和二苯亚砜作氧化剂,可将侧链保护的半胱氨酸,如Cys(Acm)、Cys(Tacm)、Cys(Bam)、Cys(tBu)和Cys(4-MeBzl)直接氧化成胱氨酸。Akaji等将此法引入多肽合成中,采用Acm基保护半胱氨酸的侧链,合成了催产素(8肽,产率56%)和人脑钠素(32肽,产率12%)。具体方法是:将多肽溶于三氟乙酸中,用l00mol·L-1的CH3SiCl3和10mol·L-1的Ph2SO作氧化剂,于25℃反应10分钟即可形成二硫键。在氧化过程中,肽链中的Met、Tyr、His和Trp(For)不受影响,未保护的Trp会有副反应产生。
7 N-碘代琥珀酰亚胺(NIS)氧化法
NIS可以直接氧化。该反应有两种机理:NIS对Cys(4-MeOBzl)的氧化是自由基反应;NIS对Cys(Acm)的氧化则通过亲电取代,首先形成RSI,再进一步形成二硫键(RSSR)。此反应与碘氧化机理不同,因为碘能直接氧化Cys (Acm),但不能直接氧化Cys(4-MeOBzl)。Bishop [2] 采用此法合成了加压素、人生长激素释放因子和apamin。一般方法是:将含Cys(Acm)或Cys(4-MeOBzl)的多肽溶于DMF或CH2Cl2中,以1.1 mol·L-1的NIS氧化反应2小时即可形成二硫键。
8 氰化碘(ICN)氧化法
ICN易溶于水和有机溶剂的混合溶剂。如在CH3OH/H2O中,ICN有较大溶解度,容易形成I+,氧化能力更强。此法与碘氧化相比较,在相同条件下ICN用量较大(50～80mol·L-1),但产率高。此氧化法不影响Met,尤其适合氧化含有Cys(Acm)和Cys (Trt)的多肽。Bishop [20] 等应用此法合成了降钙素和表皮生长因子等三个多肽片段,效果较好。
9 锍盐氧化法
在甲醇-水溶液或三氟乙醇-水溶液中,用10 mol·L-1的

可以将含有Cys (Acm)、Cys(4-MeOBzl)和Cys (Trt)的多肽先脱保护,然后氧化形成二硫键。Shih等 [21] 用此法合成了降钙素片段和sarafotoxin片段。
10 Npys氧化法
3-硝基-2-吡啶硫基(3-nitro-2-pyridylsulfenyl,Npys)作为巯基保护基团,对强酸(如HF和TFA)稳定,适合用于Boc/苄基保护策略。Npys同时有活化巯基的作用,Cys(Npys)容易进攻游离的半胱氨酸巯基,形成二硫键。此法适用于分子内或分子之间的Cys(Npys)与Cys之间形成二硫键。Cys(Npys)很容易由Cys(R)(R=Acm、But、Trt和Bzl等)与Npys-Cl反应制得 。Ploux等 在P物质类似物的合成中用此法取得了较好的效果。