近年来，从食品蛋白水解物中分离并鉴定了大量肽。其中许多肽已被证明具有潜在的应用价值，可用作改善健康状况的成分，对抗多种疾病，如癌症、炎症和心血管疾病。这些肽的功能应用效果取决于其在目标组织中的稳定性、肠道转运和体外生物利用度，而这又取决于肽的特性。因此，特性-功能参数对于肽作为功能性成分至关重要。本文综述旨在总结肽的特性（包括分子量、电荷和疏水性）对其稳定性、肠道转运和体外生物利用度的影响。
生物活性肽在作为亲本蛋白质序列的一部分时并不具有生物活性，只有在因内源性或外源性酶的作用或微生物发酵而释放出来后才会具有生物活性。一旦释放出来，生物活性肽就会发挥一些特定的生理功能。已确定的生物活性肽的健康促进特性包括抗氧化、抗糖尿病、抗高血压、抗炎和抗菌活性。大量体外研究表明，食品来源的肽对与健康相关的生物标志物具有有益影响。此外，一些来自牛奶和大豆蛋白水解物的肽在人体中的生物活性也已得到评估，并且已报告了积极的结果。
如今，口服给药仍是生物活性肽作为健康促进剂的首选给药方式。然而，由于复杂的胃肠道（GI）环境，生物活性肽的有效口服给药存在诸多困难。口服给药后，肠上皮通常会形成物理（不透性上皮）和生化（胃蛋白酶、胰蛋白酶、刷状缘肽酶、胞质肽酶）屏障，阻碍肽的吸收。根据其结构特性，这些生物活性肽可能会以完整形式到达小肠和血液循环，也可能被胃肠道蛋白酶和血清肽酶降解。此外，肠上皮会根据肽的结构表现出特定的吸收位点。对于肽在肠道中的转运，肠道中有三种已明确的机制。（1）二肽和三肽通过 PepT1 转运蛋白介导的转运。据报道，所有 400 种二肽和 8000 种三肽都能被 PepT1 识别并主动转运，而不论其氨基酸（AA）序列如何。（2）细胞旁途径，即通过细胞间连接进行的转运，这是一种不依赖能量的被动吸收途径，适用于水溶性及低分子量肽的吸收。（3）转胞吞作用。这一途径包括三个步骤：内吞摄取、通过转胞吞小泡的细胞内运输以及基底外侧分泌。由于转运途径的不同，生物活性肽通过上述三种途径的转运水平差异很大，通常在体内吸收量低于 10ppm。因此，肽的理化性质对肽的跨上皮转运及其生物利用度有显著影响。
本综述旨在评估当前文献，探讨肽的物理化学性质（包括分子量、电荷特性和疏水性）对其胃肠道稳定性、肠道转运和体外生物利用度的影响，以呈现食品源性生物活性肽进一步应用的机会与挑战。
2 肽的特性及其在胃肠道中的消化稳定性
通常，口服给药后，胃蛋白酶水解会使食物中的蛋白质变性，并形成分子量超过 10 千道尔顿的肽混合物。这些胃消化的终产物随后作为底物，由胰酶进一步水解为中等分子量和小分子量的肽。陈和李报道，在模拟胃肠道消化过程中，不同分子量的酪蛋白衍生肽的稳定性存在显著差异，他们发现分子量大于 3 千道尔顿的肽在胃消化过程中比分子量小于 3 千道尔顿的肽更容易被降解。一般认为，高分子量肽在胃肠道消化过程中更易被水解。此外，在整个胃肠道消化过程中，低分子量肽可能比高分子量肽表现出更好的结构稳定性。然而，Cinq-Mars、Hu、Kitts 和 Li-Chan研究了模拟胃肠道消化对太平洋鳕鱼片水解物中血管紧张素转换酶抑制肽活性的影响，发现低分子量活性肽比高分子量肽更易被水解。Wang 和 Li（2014 年）也报告称，在模拟胃肠道消化过程中，分子量低于 1000 道尔顿的酪蛋白衍生肽片段显示出较弱的结构稳定性。上述研究结果表明，除了分子量之外，肽的其他特性也可能影响其在胃肠道中的稳定性。
酸碱性、疏水性以及肽链的 C 端和 N 端氨基酸组成也会影响肽在胃肠道消化中的稳定性。Picariello 等人（2010 年）研究了模拟胃肠道消化过程中牛奶蛋白的存活肽，发现含酸性氨基酸较多的肽比含中性和碱性氨基酸较多的肽更稳定。Ao 和 Li（2013 年）也报道了类似的结果，即带负电荷的酪蛋白衍生肽比带正电荷的肽具有更好的消化稳定性。在疏水性方面，最近的一项研究报道，高疏水性肽组分在胃肠道消化中稳定性较差。此外，肽序列中脯氨酸和谷氨酸的含量较高会使肽更耐胃蛋白酶和胰蛋白酶。肽链末端的氨基酸组成也会影响肽对水解的抗性。当 C 端氨基酸为赖氨酸或精氨酸时，肽会被胰蛋白酶优先切割。因此，包括分子量、氨基酸组成、电荷、疏水性和氨基酸序列在内的结构特性在一定程度上影响着肽在胃肠道消化过程中的稳定性。然而，对于特定的肽而言，其胃肠道稳定性可能是上述因素综合作用的结果。在评估肽的胃肠道稳定性时，除了考虑肽自身的结构特征外，还应考虑外部因素（如 pH 值、离子强度）。
3 肽的特性与肠道转运
经过胃肠道消化后，存活下来的和/或新生成的肽到达上皮细胞，以进行下一个生理过程：转运至血液。作为前提条件，肠道转运对于生物活性肽在体内的功能至关重要。迄今为止，已确定肠道中存在三种主要机制（由 PepT1 介导的转运、细胞间转运和转胞吞作用）用于肽的跨上皮转运。对于不同的机制，肽的优选结构特征通常各不相同。
3.1 | 由PepT1介导的转运
PepT1 是众所周知的哺乳动物质子偶联肽转运蛋白，其主要功能是吸收并保留饮食来源的二肽和三肽。PepT1 的一个关键特性是其肽选择性机制，该转运蛋白能够识别并转运超过 8000 种不同的肽。肽与 PepT1 转运蛋白之间的亲和力会受到肽结构特征的影响，例如电荷、N 端和 C 端的氨基酸组成以及侧链的特性。通常，中性小肽和带电小肽都能被 PepT1 识别和转运。据报道，PepT1 对中性肽的亲和力强于对带负电荷肽的亲和力。此外，Guettou 等人（2014 年）发现，羧基末端的正电荷会削弱肽与 PepT1 之间的亲和力。因此，PepT1 转运蛋白对带电肽的亲和力依次减弱：中性肽＞带正电荷肽＞带负电荷肽。肽的疏水性也会影响肽与 PepT1 之间的亲和力。据报道，具有强疏水侧链的肽能更牢固地与 PepT1 结合。PepT1 中二肽和三肽的结合位点由保守的疏水氨基酸组成，如 Ile165、Trp306、Trp440 和 Phe441，这些位点更倾向于结合具有强疏水侧链的肽。此外，二肽的不同氨基酸组成对 PepT1 的亲和力也不同。Margheritis 等人（2013 年）研究了兔和斑马鱼中 PepT1 对不同二肽（包括赖氨酸、蛋氨酸和甘氨酸）的转运情况。结果表明，赖氨酸 - 赖氨酸和甘氨酸 - 赖氨酸的亲和力较弱，但 PepT1 能够转运大量的赖氨酸 - 甲硫氨酸和赖氨酸 - 甘氨酸。肽的修饰在一定程度上也能改变其对 PepT1 的亲和力。
埃特尔等人（2001 年）报告称 二肽 N 端的修饰会导致其通过 PepT1 的转运受到抑制。然而另一方面，经磷酸基团修饰的二肽和三肽更容易与 PepT1 结构中的酪氨酸形成氢键以及与精氨酸形成盐桥，这能够促进肽与 PepT1 之间的相互作用。
3.2 | 细胞旁转运
细胞旁途径是一种不依赖能量的转运途径，涉及通过肠上皮细胞间充满水的通道转运肽类物质。这一过程受上皮细胞间紧密连接的控制。紧密连接中的蛋白质由极性氨基酸组成，从而形成一个带负电荷的静电场。由于细胞旁途径是一种水相的细胞外途径，因此能够影响肽类物质细胞旁转运的结构特征包括分子大小、总离子电荷和疏水性。
在这些物理化学性质中，分子尺寸是最为重要的因素，因为肠上皮细胞的紧密连接对于直径大于 16 - 18 埃的分子是不可渗透的。一项先前的研究对 14 种合成模型肽在大鼠肺泡细胞单层中的转运情况进行了调查，结果表明这些肽是通过细胞旁途径转运的，且表观渗透系数 (Papp) 与分子大小成反比。此外，Pauletti、Okumu 和 Borchardt（1997 年）发现环状六肽 Ac-Trp-Ala-Gly-Gly-X-Ala-NH2 通过 Caco-2 细胞单层的渗透性高于其线性类似物。因此，对于分子尺寸较大的肽，如果肽结构具有较高的构象灵活性，它们有可能通过紧密连接扩散。就电荷而言，已有文献表明弱碱的带正电荷的阳离子通过细胞旁途径的渗透速度比中性形式快，然而弱酸的带负电荷的阴离子渗透速度则较慢。同样，一系列环状 RGD 肽的运输研究表明，净电荷为 21 至 22 的肽通过细胞旁途径的 Papp 较高。然而，一项使用具有阴离子、中性和阳离子性质的小非肽标记物的研究表明，阳离子标记物的 Papp 高于阴离子标记物。因此，尽管紧密连接空间具有负净电荷，但通过细胞旁途径运输肽的最佳电荷尚无定论。尽管分子尺寸和电荷是细胞旁选择性的主要因素，但其他分子特性，如分子几何形状和构象，也可能影响细胞旁渗透性。Chittchang、Mitra 和 Johnston（2007 年）研究了 poly(D-Glu) 的电荷和二级结构对 Caco-2 细胞模型紧密连接通透性的影响。结果表明，除了分子大小限制和电荷相互作用外，多肽的二级结构可能是决定细胞旁运输的一个决定因素。除了影响因素外，肽的疏水性也会影响其跨上皮转运。由于旁路途径被认定为水相通道，因此对于通过旁路途径吸收的肽来说，足够的亲水性非常重要。
3.3 | 转胞吞作用
在胃肠道中，转胞吞作用也是肽类物质跨上皮转运的重要途径。转胞吞作用包括三个步骤：内吞作用摄取、通过转胞吞小泡的胞内运输以及基底外侧分泌。转胞吞作用的第一步是肽与细胞膜的相互作用，这对转胞吞作用至关重要。由于细胞膜由脂质双层构成，转胞吞作用被认为是亲脂性肽的理想转运途径。因此，据我们所知，肽与富含磷脂的细胞膜之间的亲和力应随肽的疏水性增加而增强。然而，一项关于疏水性、链长和极性基团数量对模型肽通过 Caco-2 细胞模型转胞吞转运影响的研究表明，极性基团的数量比疏水性更重要。康拉迪、希尔格斯、何和伯顿（1991 年）研究了由苯丙氨酸和甘氨酸组成的中性肽和两性离子肽的结构与跨 Caco-2 细胞模型的转胞吞通透性之间的关系。结果表明，肽的疏水性与通量之间没有明显的相关性。这些结果表明，对于通过转胞吞作用转运的肽来说，适当的疏水性比高疏水性更重要。
除了疏水性的重要性之外，肽的净电荷，尤其是正电荷，也对其转胞吞作用有影响。已有研究证明，净电荷为 13 的正电荷肽是通过转胞吞作用而非细胞旁路进行转运的。此外，对于肽的转运研究还表明净电荷为 0、12 和 13 的肽的实验结果表明，转胞吞作用速率随净正电荷的增加而提高。这些结果清楚地表明，对于通过转胞吞作用转运的肽而言，净正电荷可能会促进其转运速率。
4 | 肽的特性及体外生物利用度
“生物利用度”这一术语对于确定生物活性肽的营养效率至关重要。从营养学角度来看，生物利用度表示所给肽类物质能够被吸收并用于生理功能或储存的比例。生物活性肽的潜在生理效率在很大程度上取决于其能否保持完整并到达目标器官。口服给药并经过胃肠道消化后，肽类物质会进一步被刷状缘和细胞质中的肽酶水解。通常，二肽和三肽能够完整地通过上皮细胞被吸收。相比之下，大多数超过三个氨基酸的肽在胃肠道消化和跨上皮细胞转运过程中会被水解。尽管有些肽能够抵抗模拟水解并完整地进入血液循环，但其吸收量差异很大。迄今为止，已有若干研究对肽的生物利用度进行了评估，主要通过 Caco-2 细胞单层的体外渗透实验来进行。王和李（2017 年）研究了三种不同分子量的酪蛋白肽片段的体外生物利用度，发现分子量小于 500 道尔顿的肽具有最高的体外生物利用度。安东索娃、马科娃、克拉尔和马切克（2009 年）也报告称，肽药物的体外生物利用度随着分子量超过 700 道尔顿而迅速下降。
对于分子大小超过 30 埃的肽类物质，肠上皮细胞成为其跨上皮转运的重要限速因素。就电荷而言，我们之前研究了五种具有不同电荷特性的酪蛋白肽段通过 Caco-2 细胞模型的跨上皮转运情况。结果表明，对于带负电荷的肽段，其转运速率随负电荷的增加而降低；对于带正电荷的肽段，其转运速率也随正电荷的增加而降低。充电。总体而言，中性和带负电荷的肽的转运速率高于带正电荷的肽。
除了分子大小和电荷外，疏水性也会对肽的体外生物利用度产生影响。谢等人（2015 年）研究了酪蛋白肽的疏水性与其体外生物利用度之间的关系，结果表明高疏水性肽组分具有良好的体外生物利用度。然而，另一项研究发现，肽的体外生物利用度可能会随着疏水性的增加而降低。尽管肽的疏水性一直被视为其跨细胞转运的重要特性，但当疏水性过高时，体外生物利用度会下降。此外，对于肽的体外生物利用度而言，吸收过程中肽酶的水解作用也应予以考虑。肽在体内的有效浓度取决于其转运和水解速率。一项先前的研究比较了四种酪蛋白衍生肽 YPY、SDK、IE 和 IV 在 Caco-2 细胞中的转运和水解速率。结果表明，被吸收肽段的含量顺序如下：IE（44.81%）＞SDK（21.68%）＞IV（9.50%）＞YPY（5.56%）。因此，YPY 和 IV 有效浓度的限制因素是低转运率，而 SDK 和 IE 的限制因素是水解率。
5 | 生物活性肽的未来前景
对天然和有益健康的成分的需求促使人们开始探索生物活性肽。这些肽在新型食品和制药领域具有巨大潜力。尽管一些基于肽的药物和食品已成功研发并投放市场，但在这些肽被用作功能性成分之前，还需要进行更多的临床试验。近年来，许多研究评估了肽的体外生物活性。然而，由于胃肠道的水解和吸收，体外的肽生物活性通常不等同于体内的生理效应。此外，还应更多地关注肽进入血液后的稳定性和代谢情况。对于那些容易水解或渗透性差的生物活性肽，可以采用化学修饰、酶抑制剂、吸收促进剂等必要策略来提高其转运率。
参考文献：DOI: 10.1111/jfbc.12571
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