本文将重点讨论过去 10 至 15 年中出现的当代合成策略，重点关注对合成有用的反应过程的机理方面。在简要提及合成的一般方法之后，我们将概述为促进肽环化而探索的各种构象方面。这些方面包括结构元素以及外部金属离子促进剂。我们将涵盖由含硫官能团介导的环化、环收缩策略、叠氮化物 - 炔烃环加成、环闭合复分解以及多组分环化策略。最后，我们将介绍为合成环肽库而设计的应用。金属催化的交叉偶联以及含肽键以外连接的线性前体的环化不在本文的讨论范围内。
根据其官能团的不同，肽可以通过四种不同的方式环化：头尾环化（C 端到 N 端）、头侧链环化、侧链尾环化或侧链侧链环化（图 1a）。
图 1 | 肽大环化的通用合成考虑因素。a，肽在大环中可能受到限制的四种方式。b，从侧链与固相载体相连的天冬氨酸开始，采用具有三维正交性的保护基策略合成含 RGD 的环状四肽的固相合成。c，四肽 H-Pro-Val-Pro-Tyr-OPfp 在环化过程中 C 端差向异构化的问题。Cbz 去保护 - 环化反应在 0.001 M 的浓度下进行（Cbz，苄氧羰基）。d，环状 [Pro-Ala-Ala-Phe-Leu] 所有可能的环断裂，展示了通过 Pfp 酯活化进行的环单体化和/或二聚化的分离产率。环化在 CHCl3/1 N aq.NaHCO3（2：1）溶液中以 0.0009 M 的浓度进行。
在合成环肽的各种方法中，最终的环合反应通常是内酰胺化、内酯化或形成二硫键。例如，一种有效的侧链到侧链的宏环化反应涉及天冬氨酸或谷氨酸侧链与赖氨酸残基之间的缩合反应。宏环化反应最好在高稀释度（通常为亚毫摩尔浓度）下进行，以尽量减少不必要的分子间过程，如低聚和聚合。然而，这些反应装置往往相当复杂，需要一个或多个注射泵。
将反应性分子锚定于不溶性聚合物上可产生一种假稀释现象。相对于溶液中能够自由扩散的独立分子而言，连接在不溶性聚合物上的官能团彼此相遇的可能性较小。固相大环化的主要优势在于，通常只需简单的洗涤和过滤即可完成纯化。要将肽在固相上环合，最常用的方法是通过天冬氨酸或谷氨酸等三官能团氨基酸的侧链将线性前体锚定在固相上。要构建线性肽、脱去 N 端和 C 端的保护基团、以头尾相连的方式环化，最后将产物从固相支持物上裂解下来，至少需要一个具有三个维度正交性的保护基策略。
有助于将两端连接在一起的构象要素
大环化反应的成功与否取决于线性前体能否在环合前使反应性末端在空间上预先排列得足够近。这种预先排列会形成较高的有效浓度，从而减少分子间反应产生的副产物。早在 1963 年，人们就已开始探索反应性末端空间邻近性的重要性，当时肽的环化倾向与所测得的介电常数增量相关联。线性前体的分子构象决定了所有 L 型和所有 D 型肽的宏观环化反应颇具挑战性，由于倾向于最小化烯丙基张力，它们更倾向于采取伸展构象，从而使反应性末端彼此相距较远。多年来，人们开发并综述了多种利用构象预组织来引导宏观环化的策略。在此，这些策略被分为两类：（i）“内部”构象要素，包括对肽链进行共价修饰以促进其末端的结合；（ii）“外部”构象要素，涉及使用分子支架，这些支架既不与肽共价连接，也不在环合过程中被消耗。后者属于模板介导的巨环化反应范畴，这是化学合成的一个活跃领域。
内部构象要素。在肽的环化过程中，当线性前体的各种结构要素能够以最小的张力满足过渡态中两端的角要求时，环化过程会受到青睐。戴多内和史密斯在对未折叠多肽链的端到端环闭动力学的研究中得出结论，较长肽的环闭动力学由肽内氢键的形成和瞬时β-折叠结构决定，这加速了序列中相距较远的残基之间接触的搜索。对于含有超过 10 个肽键的链，发现环闭速率常数在 20 至 100 纳秒的时间范围内表现出幂律长度依赖性。对于较长的肽，发现肽内氢键降低了环闭的自由能。较短肽的环闭动力学变慢以及缺乏肽内氢键的观察结果为短多肽链的内在刚性提供了证据。
为了帮助将线性肽的两端连接起来，化学家们着眼于二级蛋白质结构，尤其是反向转角。实现最小端到端距离的一种巧妙方法是在肽链中间引入一个顺式酰胺键，从而形成类似于β-转角的基序。由于能够同时容纳三级Xaa-Pro酰胺键的顺式和反式构象（其中Xaa代表任何L-α-氨基酸），脯氨酸在多肽中的反向转角中出现的倾向最高。尽管二级和三级酰胺的实际旋转能垒几乎没有差别，但氮原子上的额外取代基消除了一个构象相对于另一个构象的大量能量偏差。在许多蛋白质晶体结构中都观察到了脯氨酸的顺式酰胺键。在一项经典研究中，罗特及其同事利用这一特性实现了三脯氨酸的环化。
含有异旋双脯氨酸单元的线性肽是环化反应的极佳底物，这是由于 d-Pro-l-Pro 模板具有很强的诱导β-发夹结构的特性。借助这一片段组装的环肽，罗宾逊及其同事能够精确重现抗体片段晶体结构中互补决定区环的典型构象。
将其他 d 型氨基酸掺入全 l 型肽中也已知会产生诱导转角的作用。实际上，这一策略已被用于提高各种肽环化的产率。对于仅在末端残基的α-碳构型上不同的两个非对映异构体短肽序列，环化更有利于在末端同时含有 d 型和 l 型残基的非对映异构体。仅由 l 型残基组成的肽，若缺乏其他诱导转角的结构，通常要等到 C 末端的α-碳异构化为 d 型构型才会环化。d 型氨基酸对肽大环化的影响也已通过理论模型进行了研究。
N-甲基氨基酸对肽链主链的立体化学影响与脯氨酸类似。它们有可能在肽序列中引入顺式酰胺键，并且非常适合诱导β-转角。凯斯勒及其同事已充分证明了将它们作为诱导转角的元素引入环肽中的情况。
陶顿和邓在合成天然产物角海绵素酰胺时记录了一个引人入胜的例子，该例子说明了线性前体构象的重要性。这种通过修饰的环状七肽含有两个脯氨酸残基、一个噻唑环和一个噁唑啉环。它在生物合成过程中以两种不能相互转化的脯氨酸酰胺构象异构体的混合物形式存在。作者发现，在大环化之前线性前体中是否存在由苏氨酸衍生的噁唑啉环决定了这两种构象异构体的动力学分布。
伪脯氨酸是从丝氨酸和苏氨酸（（4S）-氧杂环丁烷-4-羧酸）以及半胱氨酸（（4R）-噻唑烷-4-羧酸）衍生而来的修饰杂环氨基酸。它们最初被引入作为结构破坏性构建模块，以防止肽在固相合成过程中聚集和自缔合。它们可通过丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸与醛或酮在酸催化下环合而容易获得。当被整合到肽链中时，这些残基主要诱导其前的酰胺键形成顺式构象，从而形成 VI 型β-转角结构。多个研究小组已将这些残基用作合成短的、受约束的环肽的强大转角诱导元素。其中一个显著的例子是 Mutter 合成环三肽环-[Pro-Thr(ΨMe,Mepro)-Pro]，其起始原料为 H-Pro-Pro-Thr(ΨMe,Mepro)-OH（图 2a）。该肽被证明能与 PyBOP（苯并三唑-1-氧基三吡咯烷基磷六氟磷酸盐）在高产率下瞬间环合，且无低聚物结构，浓度高达 0.1 M。
图 2 | 通过构象控制促进肽环化。a，一种源自 L-苏氨酸的假脯氨酸修饰的三肽的浓度无关环化。b，不含转角诱导剂的环己肽的合成。在 0.01 M 的 FDPP 浓度下，嵌入三个假脯氨酸残基的线性前体发生环化。环化后，在水性酸性条件下，转角诱导的假脯氨酸被还原为相应的苏氨酸残基。c，通过 FDPP 或 DMTMM BF4 偶联试剂在高稀释度（0.005 M）下环化，合成 C2 对称的全 L 型环化四肽，其中包含两个交替的假脯氨酸残基。环化后，在酸性条件下水解假脯氨酸以释放相应的天然氨基酸残基。d，楔形碳硅烷树枝状碳二亚胺通过位点隔离机制环化同二酮哌嗪。未观察到相应的二聚化产物。e，分离的硫酯酶结构域通过转酰化后强制预环化构象促进抗菌环肽的仿生合成。一种固相线性前体。DIPEA，N,N-二异丙基乙胺；DMTMM BF4，4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓四氟硼酸盐；PEGA，聚乙二醇聚丙烯酰胺共聚物；SPPS，固相肽合成；TFA，三氟乙酸；TIS，三异丙基硅烷。
使用伪脯氨酸作为构象转角诱导剂的一个额外好处是，在环化之后，它们可以在酸性条件下被裂解，从而释放出相应的丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸残基，从而得到不含转角诱导元素的环肽。Jolliffe 及其同事将这一策略应用于 H-(Val-Thr)3-OH 的环化，这是一种缺乏转角诱导元素且无法通过常规头尾方式环化的六肽（图 2b）。作者还能够证明，含有两个交替伪脯氨酸残基的线性四肽可以通过头尾方式环化，从而得到受约束的全 l 型环状四肽（图 2c）。应当指出的是，尽管伪脯氨酸非常有用，但它们的一个主要缺点是由于空间拥挤，NH 伪脯氨酸极难酰化。为了合成这些 N-酰化杂环，最典型的方法是首先制备二肽片段（含丝氨酸或苏氨酸），然后形成伪脯氨酸。
外部构象要素。用于辅助肽大环化的外部模板基于位点隔离机制发挥作用。聚合物支架能够形成仅允许一条线性肽分子一次进入并环化的反应腔。这种独特的纳米环境将肽与主体溶液隔离开来。因此，这些内部腔体所产生的隔离效应显著降低了环寡聚化的可能性。范·马尔塞文及其同事通过开发碳硅烷树枝状碳二亚胺应用了这一策略。这些楔形偶联试剂通过其树枝状的体积产生位点隔离效应，通过其 C 端捕获内酰胺化前体（图 2d）。作者证明了这些树枝状碳二亚胺能够环化七元双内酰胺（同二酮哌嗪），而通过传统内酰胺化方法很难获得此类化合物。
泰及其同事开发了另一种用于增强四肽难以实现的环化反应的外部模板。他们的方法基于分子印迹空腔。这种策略是通过纳米级空腔维持线性肽中顺式酰胺构象的转角结构来实现的。
自然界中的许多大环肽是通过非核糖体生物合成产生的。已知非核糖体合成酶通过硫酯键连接活化的线性中间体，其方式类似于固相合成。沃尔什及其同事描述了一种方法，其中分离出的硫酯酶促进固定在合成固体支持物上的线性肽的环化。该机制涉及向活性位点丝氨酸的转酰化，随后在分子内氨基末端亲核试剂的攻击下脱酰化。这项研究表明，分离出的硫酯酶能够将固相连接的硫酯和酯连接的线性肽强制成预环化构象。这种通用的化学酶方法可用于生产强效抗菌剂（图 2e）。须贺将 tRNA 酰化核酶与重组无细胞翻译系统的结合使用，已用于制造通过硫醚键连接的肽大环。
金属离子辅助环化
另一种基于外部非共价辅助剂促进肽大环化的策略涉及金属离子的使用。这一策略的灵感源于一些天然存在的环肽，如杆菌肽、瓦利尼霉素和阿纳他尼肽是强效的离子载体，并且在体内能与金属离子形成稳定的复合物。贝克及其同事首次展示了利用金属离子使肽构象预组织以促进大环化的实例（图3a）。他们发现，在碱性条件下，通过金属离子介导的两个未活化的二肽甲酯的二聚化，可以构建C2对称的环四肽。实现双头尾缩合的前提是两个二肽酯必须首先以反式方式配位到金属中心（与顺式配合物处于平衡状态），从而允许配位的氨基对邻近的二肽酯进行亲核攻击。这种环二聚化方法涵盖了从12元到18元的多种环大小。环肽（由α和β氨基酸组成）无需高稀释、保护或活化基团，也不需要偶联试剂。通过与适当的阳离子沉淀，可分离出金属配位的二阴离子，且金属离子可通过酸性甲醇解交换为质子。
图 3 | 金属离子在肽大环化中的应用。a，过渡金属介导的未活化二肽酯的环二聚化。b，钠离子通过肽链上酰胺氧原子的串联配位来增强肽的头尾环化。c，Ag+离子介导的肽硫酯大环化中 pH 依赖的化学选择性。在 pH 4 时，N 端和赖氨酸侧链的氨基质子化，有利于与酪氨酸残基的酚氧阴离子发生大环化。在 pH 5 - 5.7 之间观察到头尾环化占优势。在 pH 6 以上，赖氨酸残基的 ε-氨基与肽链发生内酰胺化变得显著。DEPBT，3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮；PPN；双(三苯基膦)亚胺鎓。
多种碱金属已被证明能促进肽的环化。例如，锂盐最早被报道能提高肽在有机溶剂中的溶解度，罗比及其同事发现其能介导几种 N-氯乙酰化、C-半胱氨酸肽的选择性环化，这些肽模拟了 HIV-1 包膜糖蛋白 gp120 中的 C4 结构域。在水性条件下，这些肽仅以头尾相连的方式聚合。然而，在 LiCl/二甲基甲酰胺溶剂混合物中，通过 C 末端半胱氨酸硫醇对 N 末端氯乙酰基团的亲核取代，观察到了专一的单体环化。叶及其同事表明，钠离子适合促进线性五肽的环化，而较大的铯离子能有效促进七肽的环化。基于分子力学计算，叶及其合著者提出，这些碱金属离子通过首先与肽 C 末端的羰基和酰胺基团结合来促进肽的宏环化，通过酰胺氧的进一步配位。链上的这些离子会促使线性肽形成一个强的转角结构，从而使 N 端和 C 端靠近，便于环化（图 3b）。
谭和张还利用了金属离子促进肽大环化的能力。受银（Ⅰ）对硫、氮、氧亲和力顺序为 S＞N＞O 的启发，以及布莱克和李关于硫酯焓活化实现有效片段偶联的开创性工作，谭和张能够证明，在水缓冲溶液中，当银离子的当量数为三个或更多时，线性肽硫酯能够轻易地发生环化。在此应用中，银离子同时起到熵活化剂和焓活化剂的作用。通过与 C 端硫酯和 N 端胺配位，银离子将反应性官能团捕获在近邻位置，从而实现酰基转移环合。银离子的亲硫性在与硫酯络合时产生焓活化，使其成为更好的离去基团，从而促进酰基转移反应。未保护的肽可以在溶液中单独或作为肽混合物进行环化。当将酪氨酸和赖氨酸（这两种是竞争性亲核残基）引入肽的主链时，大环化的化学选择性将取决于溶液的 pH 值。然而，与任何通过高度活化的 C 端酯进行大环化的方法一样，银离子促进活化时可能会出现差向异构化的问题，而且如果环合反应缓慢进行，这一问题会更加严重（图 3c）。
硫介导的环化反应
许多关于肽大环化的合成研究都从自然界中汲取灵感。随着用于肽偶联的先进试剂的不断发展，这些仿生方法采用 C 端羰基的硫酯活化。
受咪唑在活化酰基的水解和转移催化中所起的普遍作用的启发，霍顿及其同事开发了一种在咪唑存在下通过肽硫酯的直接氨解来实现环肽头尾合成的方法（图 4a）。咪唑的作用被认为是亲核催化剂，它攻击硫酯的羰基形成活性酰基咪唑中间体，随后被另一个亲核试剂捕获。从 5 到 11 个残基长度的各种肽被环化，发现其速率取决于环的大小。通过咪唑催化的 C 端硫酯与丝氨酸残基侧链羟基之间的大环内酯化反应，以良好的产率合成了卡哈拉肽 B 及其类似物。
图 4 | 通过含硫辅助剂介导的肽大环化。a，由咪唑催化的五肽硫酯的头尾大环化。b，使用 Sanger 试剂的五肽硫酯的头尾大环化。该环化反应与未保护的谷氨酸和色氨酸侧链残基相容。c，在固相上通过硫烯反应进行的侧链到尾部的大环化。这环化反应由 I 型光引发剂 DMPA（2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮）在 365 纳米光照射下引发。d，通过形成噻唑啉环，随后发生 O 到 N 的酰基转移，N 端半胱氨酸与 C 端甘油酯肽进行头尾环化。e，原位化学连接应用于肽的头尾环化。N 端半胱氨酸残基与 C 端硫酯进行环状反式硫酯化，随后的 S 到 N 酰基转移生成所需的内酰胺化产物。f，一种可去除的 N 端氧乙基硫醇连接应用于肽的头尾环化，通过类似于原位化学连接的反应途径，无需 N 端半胱氨酸残基。g，通过无痕 Staudinger 连接策略实现肽的头尾环化。
克里奇和佐佐木开发了一种利用肽硫酸酯和桑格试剂形成酰胺键的序列，该序列可用于五肽和六肽的环化反应。用哌啶处理 N 端 Fmoc 保护和 C 端 9-芴甲基硫酯肽，会释放出一种半硫酸酯肽，该肽在 0.005 M 桑格试剂（Fmoc，9-芴甲氧羰基）存在下发生环化反应。反应通过与桑格试剂的初始 SNAr 反应生成原位活性硫酯进行，然后被 N 端氨基捕获。该方法与游离羧酸和羟基相容。例如，作者能够从相应的保护线性肽出发，以 44% 的总收率分三步合成环-(d-Glu-Ala-d-Val-Leu-d-Trp)（图 4b）。四肽不适用于这种环化策略，因为处理 Fmoc-Ala-Trp-Gly-Phe-SFm 只得到环二聚体产物，产率为 40%（SFm，9-芴甲硫酯）。
通过侧链与侧链的连接实现肽的分子内稳定化这一方法由费利克斯及其同事率先提出。将肽限制成大环的最便捷、最直接的方法之一是通过连接两个内部半胱氨酸的硫醇基团。由此形成的分子内二硫键能够稳定肽中的二级结构基序。要实现这种环化，需要一种氧化剂（如大气中的氧气、碘、二甲基亚砜或二（2-吡啶基）二硫化物）。在溶液中或固相上构建线性肽序列时，两个硫醇基团都用相同的基团封端，这些基团在环化之前可以正交切割。通常，硫醇基团用能够同时脱保护并形成二硫键的保护基团保护。例如，S-乙酰氨基甲基（Acm）和S-三苯甲基（Trt）保护基团都可以用分子碘去除，生成亚磺酰碘中间体，该中间体要么在歧化反应中与另一个亚磺酰碘反应，要么被保护的硫醇基团攻击，从而原位生成二硫键。通过侧链连接实现结构稳定化是一种非常有效的方法。这是一个活跃的研究领域，但超出了本综述的范围。
半胱氨酸的巯基官能团也可用于分子内的巯基-烯烃反应来生成肽大环。安塞斯及其同事63曾采用这种侧链到肽尾的环化策略。这种大环化涉及肽链 N 端半胱氨酸残基的巯基与肽链 C 端赖氨酸残基的 ε-NH2 上的烯丙氧羰基保护基团的双键进行自由基加成（图 4c）。该环化反应在固相支持物上效果最佳，但也可在溶液相化学中进行，所需浓度较低（0.002 M）。
N 端半胱氨酸残基上存在的 1,2-氨基硫醇官能团已被应用于一系列大环化策略。其中一种方法涉及与醛进行分子内缩合，形成稳定的噻唑啉杂环。谭及其同事证明，含有 N 端半胱氨酸残基和连接赖氨酸残基侧链的醛官能团的未保护线性肽容易缩合，从而得到嵌入噻唑啉环的侧链到尾部的环肽。此外，他们还能够证明，如果将醛作为氧化的 C 端甘油酯并入线性前体中，那么通过一种新颖的环收缩机制，即可获得具有全酰胺键骨架的头到尾环肽。该机制通过三环分子内重排进行（图 4d）。
1,2-氨基硫醇在当代依赖捕获/重排机制将两个肽片段连接在一起的连接策略中也取得了巨大成功。特别是原位化学连接生动地展示了这种机制在温和条件下连接肽片段的强大能力。该过程涉及两个片段之间的反应，其中一个片段是弱活化的 C 端硫酯，另一个是未保护的 N 端半胱氨酸残基。酰胺键相对于硫酯的热力学强度是该反应的驱动力，通过邻近驱动的 S 到 N 酰基迁移得以实现。Tam 和 Pallin 能够证明，含有 N 端半胱氨酸残基的 C 端肽硫酯容易以头尾方式环化（图 4e）。这种大环化可以在存在竞争性侧链官能团（如赖氨酸的 ε-NH2 基团、内部半胱氨酸的硫醇或组氨酸的咪唑）的情况下进行。在环链互变异构平衡的控制下，长度从 5 到 26 个氨基酸残基的肽能够环化，仅产生微量的低聚物产物。
缪尔和卡马雷罗报道了一种天然化学骨架环化反应，该反应涉及一个完全脱保护的 15 个残基的肽，其 N 端为半胱氨酸，C 端为硫酯。在高稀释度（0.0005 M）和接近中性 pH 值的条件下，头尾环化反应顺利进行。在环化步骤中同时加入了 PhSH 和 BnSH。这些试剂作为亲核催化剂，使分子间转硫酯化途径得以实现，从而生成一个更具亲电性的 C 端活性硫酯和一个在半胱氨酸硫醇攻击羰基后更易离去的基团。天然化学连接的协议也已扩展到固相大环化化学领域。
道森在合成蛋白质环链时甚至使用了天然化学连接法实现大环化，其中两个环肽相互交织在一起。塔姆及其同事提出的“硫拉链反应”也以 S 到 N 的酰基迁移为核心；该策略已应用于富含半胱氨酸残基的大肽的端到端环化。此级联反应所需的关键官能团包括肽链 N 端的半胱氨酸、一个硫酯以及至少一个嵌入肽链内部的游离巯基。
尽管上述提到的由 S 到 N 的近距驱动酰基迁移大环化策略十分有效，但其主要缺陷在于 N 端必须有半胱氨酸残基，这限制了其合成用途。为了克服这一结构要求，肯特及其同事能够通过在 N 端氨基酸的α-氨基上连接一个氧乙硫醇基团来模拟 N 端半胱氨酸的侧链 。他们能够有效地进行原位化学环化反应，与 C 端硫酯结合，合成不含半胱氨酸残基的头尾环肽，且未检测到环低聚物。在 S 到 N 的酰基迁移后，N-α-氧乙硫醇基团可以通过在稀醋酸中用锌粉还原去除，从而得到环肽的天然骨架结构（图 4f）。最近，道森和严开发了一种更实用的方法，通过原位化学连接法来环化不含半胱氨酸残基的肽。在初始的原位化学大环化反应中，N 端半胱氨酸残基与 C 端硫酯结合，该环肽可通过与雷尼镍进行脱硫反应而失去其半胱氨酸中的硫。
哈肯伯格和克莱因维舍德开发了一种基于硫酯的环化策略，其方法基于一种无痕的施陶丁格连接（图 4g）。在肽的 C 末端与硫酯相连的膦与位于 N 末端的叠氮化物发生分子内反应，形成环状亚胺磷烷。随后，该环收缩形成酰胺键，因为氮杂叶立德攻击了硫酯的亲电中心。这种大环内酰胺化过程已被证明适用于几种完全脱保护的肽的环化，这些肽由 11 个氨基酸残基组成。这为直接获得环肽提供了途径，无需进一步的脱保护步骤。
涉及内酯的环收缩策略
通过形成一个更大、更灵活的大环，然后通过分子内环收缩来获得所需的目标化合物，这是减轻大环化熵损失的有效方法。安布拉德及其同事利用 O 到 N 迁移策略合成了环肽。安布拉德的策略基于首先对构象灵活的肽酯进行大环化，然后进行 O 到 N 酰基迁移以生成同源环肽（图 5a）。肽序列首先从固定在固相载体上的 N-Boc 保护的丝氨酸侧链构建，形成 O-酰基异肽键（Boc，叔丁氧羰基）。从固相载体上切割下来后，在高稀释条件下将肽酯环化，生成相应的环状类似物。去除丝氨酸残基的 N-Boc 保护基后，在碱性条件下进行最终的 O 到 N 酰基迁移，以中等产率生成天然环肽。该策略已证明适用于环五肽和环六肽的合成，然而安布拉德及其同事观察到对于构象更受限制的四肽衍生物，酰基迁移步骤并未进行。
图 5 | 通过涉及较大内酯环的环收缩实现肽的内酰胺化。a，一种环收缩策略，通过将一个肽酯的酰基从 O 移至 N 以生成同源五肽环肽。首先从丝氨酸残基的侧链构建线性前体。从固相载体上切割下来后，进行大环内酰胺化以生成肽酯。随后进行 Boc 保护基脱除，释放出丝氨酸残基的α-氨基，从而发生酰基转移反应。b，一种光可裂解辅助基团 HnB 用于环化具有挑战性的五肽 H-Ala-Phe-Leu-Pro-Ala-OH 的环收缩策略。将该辅助基团引入肽的 N 端后，环化通过初始的环状硝基苯酯进行，该酯预先组织肽进行内酰胺化，通过分子内 O 到 N 的酰基转移生成同源五肽环肽。c，一种由水杨醛衍生的辅助基团，首先作为肽大环内酰胺化的灵活铰链。随后进行 Boc 保护基脱除，大环在碱性条件下通过环收缩进行 O 到 N 的酰基转移。然后在酸性条件下将位移的辅助基团裂解，从而得到所需的同二酮哌嗪。EDCI，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐
Meutermans、Smythe 及其同事开发了一种涉及内酯的另一种环收缩策略，并将其应用于小肽的头尾环化反应。通过还原胺化，将一种水杨醛衍生的辅助基团连接到肽链的 N 端。C 端的活化最初导致形成更容易接近的内酯。这使 N 端靠近 C 端，并促进了 O 到 N 的酰基转移（图 5b）。这种活化氨基酸的酰基捕获方法随后与基于 2-羟基苯甲基的辅助基团进行酰基转移，最初由 Sheppard 及其同事开发，作为实现受阻肽酰胺主链取代的有效方法76。Smythe 及其同事选择 2-羟基-6-硝基苯甲基（HnB）作为辅助基团，因为它具有光不稳定性，在大环化后可以去除。作为概念验证，难以环化的五肽 H-Ala-Phe-Leu-Pro-Ala-OH（图 1d）与 HnB 连接，在 0.001 M 浓度下以 45% 的产率环化。作者还应用这种环收缩策略合成了环四肽库。他们甚至能够证明，这种策略适用于合成高度受限的全 L 型环状四肽。如果在其中一个主链酰胺氮原子上安装一个额外的 HnB 单元，以影响顺式酰胺转角结构，从而有助于将末端拉得更近，那么这种困难的环化反应是可行的。
范·马尔塞文及其同事开发了一种用于困难大环内酰胺化的钳形辅助策略。在他们的方法中，将水杨醛衍生的辅助基团引入线性肽的主链中，形成一个灵活的连接体或“铰链”，从而实现头尾大环内酰胺化。随后的环收缩涉及一个 O 到 N 的酰基转移反应（图 5c）。在这里，水杨醛衍生的辅助基团作为大环内酰胺化的模板，其成功之处在于两方面。首先，由于芳基酯对氨解的高反应性，带来了焓激活。其次，辅助基团正确地将仲胺和羰基官能团定位在环收缩时的近邻位置，从而带来了熵激活。该策略已成功应用于几种难以合成的同二酮哌嗪的合成。
叠氮化物-炔烃环加成反应
从海洋生物中分离出的大量具有生物活性的结构包含有嵌入较小杂环的环肽。在一些例子中，噻唑和恶唑环的存在对相应的大环施加了构象限制。因此，将杂环引入环肽的主链越来越受到关注，尤其是在药物化学领域。这
1,2,3-三唑是一种特别引人关注的杂环化合物，因为它在热力学和生理学上都很稳定。根据其取代模式，它可以作为反式或顺式酰胺键的有效等电子体。正如 Huisgen 最初所展示的那样，这种杂环化合物可以通过叠氮化物和炔烃之间的 1,3-偶极环加成反应轻松获得。最近，Meldal 和 Sharpless 的研究小组开发了一种在温和条件下由铜（I）催化的高度区域选择性变体，以生成 1，4-二取代模式。这种“点击”化学此后已成功应用于肽的环化。
之前无法获得的环状[Pro-Val-Pro-Tyr]10（图1c）的三唑类似物可以通过N端叠氮化物和C端炔烃的环加成反应轻松合成（图6a）。重要的是，这些等排体被证明保留了其酪氨酸酶抑制活性。
图 6 | 肽大环合成中的叠氮 - 炔烃环加成反应。a，酪氨酸 - 丙氨酸 - 缬氨酸 - 丙氨酸的点击介导大环化。b，通过两种叠氮 - 炔烃点击反应的串联二聚 - 大环化方法（上）或通过效率较低的传统大环内酰胺化方法（下）合成环肽纳米管。c，环四肽 apicidin 的三唑修饰类似物的合成。上：在固相上通过钌催化形成 1，5- 二取代 1，2，3- 三唑，随后进行大环内酰胺化，得到类似于 apicidin 生物活性构象的类似物。下：通过铜（Ⅰ）催化的分子内叠氮 - 炔烃环加成反应，得到类似于 apicidin 在溶液中的主要构象的类似物。d，通过固相连接的叠氮肽基磷叶立德的分子内环化裂解合成含 1，5- 二取代 1，2，3- 三唑的环四肽类似物。HATU，2-(7-氮杂 -1H- 苯并三唑 -1- 基) -1，1，3，3- 四甲基脲六氟磷酸酯；NMP，N- 甲基 -2- 吡咯烷酮；TBTA，三[（1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基）甲基]胺。
Lokey 及其同事进一步证明了该反应作为大环化工具的实用性。他们能够对富含亮氨酸的四肽、五肽、六肽和七肽进行固相支持环化。在许多铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应中都观察到了二聚体和三聚体副产物的形成。Ghadiri 及其同事利用了这一现象；通过由几个串联点击反应实现的串联二聚化-大环化方法，他们能够合成 C2 对称的环肽支架，这些支架被证明能够自组装成肽纳米管。这种方法比对已经包含两个三唑单元的线性前体进行常规大环内酰胺化取得了更大的成功（图6b）。
1,4-二取代的 1,2,3-三唑是已知的反式酰胺键的替代物。加迪里及其同事已证明，将一个或两个此类基团引入已知对生长抑素（SST）受体具有强结合亲和力的环状四肽中，可生成构象均一的类似物。实际上，这些伪四肽即使在 70°C 时也仅呈现一种构象。
另外，1,5-二取代的 1,2,3-三唑已被证明是有效的顺式酰胺键替代物，能诱导转角结构基序。这些化合物可以通过钌（II）催化的叠氮化物和炔烃的 1,3-偶极环加成反应以区域选择性的方式制备。加迪里及其同事能够将这些杂环作为顺式酰胺等排体引入一种天然存在的环四肽中。这是通过在固相上首先进行钌（II）催化的形成含线性肽的 1,5-二取代 1,2,3-三唑，然后对假四肽进行常规的环合反应来实现的（图 6c）。通过这种方式，他们能够制备出构象均一的阿皮西丁类似物。典型的环四肽在溶液中呈现全反式酰胺结构，然而其生物活性构象包含一个顺式酰胺旋转异构体。实际上，作者能够证明其引入 1,5-二取代 1,2,3-三唑的类似物显示出与天然存在的阿皮西丁相似的生物活性。
最近，拉德曼和阿桑努拉成功报道了叠氮基炔基肽的首次环化反应，从而合成了含 1,5-二取代三唑的环肽。他们开发了一种基于固相支持策略的环化裂解方法，其中环化和从固相支持上裂解在同一个化学反应中进行。这种方法便于纯化，因为开链寡聚副产物仍附着在固相支持上。该化学反应涉及聚合物结合叠氮基肽基磷叶立德的二极环加成，避免了使用氨基酸炔烃，并且无需金属（图 6d）。
环合复分解反应
在形成碳-碳键方面，烯烃复分解反应的出现为大环化领域带来了广泛的应用。格鲁布斯及其同事开发的高度耐受官能团的钌基催化剂极大地促进了有机化学这一领域向肽类及相关生物体系的拓展。格鲁布斯及其同事率先将环合复分解（RCM）策略应用于构象刚性化氨基酸和肽类95。受一类天然存在的、通过二硫键稳定化的β-转角结构基序的启发，他们在这些四肽序列中用碳-碳键取代了二硫键。这是通过烯丙基甘氨酸残基之间的 RCM 反应实现的，并且发现该反应能够耐受酸性酰胺 NH 质子以及未保护的酪氨酸酚基（图 7a）。
图 7 | 环合复分解反应在肽大环合成中的应用。a，通过环合复分解反应实现侧链到侧链的环化并稳定β-转角结构。标红的酸性基团已被证明与该过程兼容。b，在七肽中两个烯丙基甘氨酸残基之间的环合复分解反应形成碳基连接，使 N 端和 C 端更接近，从而实现有效的大环内酰胺化。随后切断烯烃连接，并通过几次交叉复分解反应，可获得类似于天然产物马哈法西林 B 的肽大环。
在这一开创性工作之后，其他几个研究小组也通过基于烯烃的“支架”成功稳定了肽中的二级结构元件，不过这些概念并非本综述的重点，读者可参考其他文献。罗宾逊及其同事发现了茂金属催化的复分解反应在促进肽大环化方面的不同应用。他们含烯烃的连接体由两个策略性放置的烯丙基甘氨酸残基之间的交叉复分解反应形成，使肽的 C 端和 N 端更靠近，从而通过常规的内酰胺化化学促进大环化（图 7b）。该方法被应用于类似于天然产物马哈法西林的七肽的头尾环化。在安装了碳环连接体后，与 FDPP（五氟苯基二苯基磷酰）反应，以 55%的产率得到环化衍生物。
异氰酸酯和多组分反应的应用
乌吉四组分反应（U-4CR）是构建基于肽素框架的多功能工具。韦斯约汉及其同事将这种多组分反应应用于含 RGD 环状肽素的合成（图 8a）。他们的策略涉及三个连续的乌吉反应。这前两个连续的 Ugi 四组分反应构建了含 RGD 的非环状前体。脱保护后，再采用另一个 Ugi 三组分四中心反应实现肽模拟物的环化。
图 8 | 多组分反应介导的肽环闭合。a，通过连续的 U-4CR 反应合成环状 RGD 五肽类化合物。首先采用两个连续的 U-4CR 反应构建非环状前体，随后对其端基进行脱保护处理，再通过 Ugi 三组分四中心反应实现肽类化合物的环化。b，通过与两性环氧乙烷醛和异氰化物的多组分反应将六肽限制在一个大环中。所得含 N-酰基环氧乙烷的大环随后可通过与 7-巯基-4-甲基香豆素的开环反应进行位点特异性修饰。c，Ugi 介导的与环氧乙烷醛的环化反应中观察到的高非对映选择性的可能解释。
另一个使用 U-4CR 的例子来自 Kazmaier 及其同事的实验室。他们构建环状肽模拟物的方法涉及 N-烷基化氨基酸，这些氨基酸被整合到四组分 Ugi 反应中以构建线性前体，随后进行环化复分解反应（RCM）。通过这种方法，可以在环中的任何位置放置不同的极性、亲水性和疏水性基团。
丹尼舍夫斯基及其同事开发了一系列新颖的异氰酸酯介导的酰胺偶联方法，用于合成具有挑战性的 N,N-二烷基化酰胺。在最近的一项杰出工作中，他们将该方法应用于环孢素 A 的全合成。通过一系列异氰酸酯介导的偶联反应将各个肽单元连接在一起。
静电控制的环化反应
短肽在水溶液中通常呈无规卷曲状态，这是由于水能够破坏肽链内的氢键。然而，在极性有机溶剂中，短线性肽倾向于形成环状构象，这是由 N 端和 C 端之间的离子对作用所驱动的。利用这种行为可能会开发出有效的环化策略，因为旨在在整个环化过程中维持 C 端和 N 端之间离子对作用的反应能够利用静电诱导的预环化构象体。为此，尤丁及其同事对未保护的 NH 偶氮环醛、异氰酸酯和线性肽进行了反应（图 8b）。
图 9 | 肽大环化合物库开发策略。a，用于合成环肽的分裂内肽酶介导的环化连接。b，用于开发环肽模拟物库的 MATCH 技术反应方案。展示了所用各种连接体的几个示例（以蓝色显示）。c，数字微流控技术已用于通过组合试剂的离散液滴来创建环肽库。这实例表明，二肽 H-Pro-Leu-OH 和氨基酸甲硫氨酸在同一个芯片反应器中通过与氮丙啶醛和异氰化物的液滴混合而同时环化。随后，通过进一步与含硫苯甲酸的液滴混合，实现了甲硫氨酸产物的位点特异性修饰。DCM，二氯甲烷；DIAD，二异丙基偶氮二甲酸酯；HBTU，2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯；KOTMS，三甲基硅钾。
这种多组分方法能高效地生成具有高化学选择性和立体选择性的环肽，且无异构化、环二聚化或低聚化的迹象。具有挑战性的中等大小环肽易于制备；反应时间不到 10 小时，产率高。该反应能以高摩尔浓度生成肽大环，与线性肽前体的长度无关。据认为，环丙烷醛的醛基中心与线性肽前体的 N 端之间形成的亚胺离子是由静电稳定的离子对提供的。尤丁及其同事提出，两性环丙烷醛的α位存在亲核中心是高产率和高非对映选择性的原因。当在反应中使用单官能团醛与异氰酸酯和肽时，观察到低非对映选择性（图 8c）。更重要的是，通常在线性肽（少于六个残基）的 U-4CR 环化过程中发生的不期望的环二聚化现象未被观察到。环肽该产品包含一个氮丙啶修饰位点，在合成的后期阶段可以在此位点连接肽类和非肽类侧链。
结论与展望
后基因组时代将继续提供有关生物靶点的新信息，尤其是蛋白质 - 蛋白质相互作用方面的。这类难以攻克的问题无法用小分子来解决。随着越来越多的蛋白质 - 蛋白质相互作用被证实为治疗干预的目标，对能够进行长时间相互作用的分子的需求将会不断增长。针对此类分子的灵活合成策略应当能够实现后期构象调整和溶解度优化。最终目标是调节能够穿过细胞膜的分子中的二级结构。随着合成方法的复杂性不断提高，我们肯定会见证新型明确表面的发现，我们将其称为特权折叠。肽大环为探究此类复杂结构提供了理想的机会。
参考文献：DOI: 10.1038/NCHEM.1062
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