摘要：将诊断和治疗疾病的功能整合到一个纳米系统中的诊疗纳米材料已成为纳米医学研究的核心兴趣之一。功能肽可以整合到诊疗纳米材料中，赋予其特殊性能，从而完成更为复杂的生物医学任务。基于肽的诊疗纳米材料可以被设计成具有特定靶向性、跨膜传递和刺激响应等功能。在这篇小型综述中，我们描述了基于肽的诊疗纳米材料的一般制备思路，涉及设计和多样的生物医学应用，并重点介绍了过去 5 年来取得的进展。
1 引言：2015 年，美国政府宣布了精准医疗计划，旨在使精准的个性化患者护理成为临床现实，即根据个人的基因、生活方式和环境量身定制医疗保健。为了实现这一雄心勃勃的目标，开发了具有一个或多个临床潜力的新型基于纳米技术的设备和治疗性纳米材料。其中，将疾病诊断和治疗结合在一个纳米系统中的诊疗一体化纳米材料已成为纳米医学研究的核心兴趣之一。诊疗一体化纳米材料主要是通过精心将诊断和治疗剂封装或连接到纳米颗粒中来构建的，旨在评估病理状况、监测治疗反应、提高药物疗效和安全性、消除对患者的不必要治疗，并降低整个医疗保健系统的成本。与治疗剂或诊断剂类似，诊疗一体化纳米材料也需要利用病变的特定性质或微环境来实现更精确和高效的功能。
肽由通过酰胺键连接的氨基酸组成，通常长度在 50 个氨基酸以内，在生物体中广泛存在。作为蛋白质的片段，肽本质上是可生物降解和生物相容的。此外，这种均一性还确保了肽的生物活性，包括特定位点结合、刺激响应和治疗作用。这些优点使肽成为生物医学材料的理想构建单元，具有广阔的临床应用前景。在过去的几十年里，合成方法的改进和肽库筛选技术的发展确保了肽在包括诊疗纳米材料在内的生物医学系统中被广泛用作靶向配体、生物响应单元和治疗剂。
这篇小型综述主要聚焦于过去 5 年中肽修饰的诊疗纳米材料，尤其是在癌症治疗领域。文中将功能肽分为三类进行讨论：靶向肽、环境响应肽和其他功能肽。本综述涵盖的代表性肽类列于表 1 中。我们描述了将肽引入诊疗纳米材料的一般思路，并重点介绍了当前应用这些概念的先进实例（图 1）。
图1 ：基于肽的诊疗纳米材料方案。功能肽可单独使用，也可与其他功能成分协同作用，以完成所需的生物医学任务。
2 靶向肽
精准医疗和现代纳米药物的基本需求是实现特定部位的靶向治疗，以确保安全有效的治疗效果。病变部位，如肿瘤部位，与健康组织相比具有不同的特征。靶向肽种类繁多，主要通过肽库筛选技术发现。这种筛选过程确保了高亲和力和靶向能力。根据靶向部位的不同，靶向肽可分为三大类：细胞靶向、病变微环境靶向和亚细胞器（细胞核、内质网、线粒体等）靶向。
癌症是威胁人类健康的最严重威胁之一，在过去的几十年里得到了深入研究。癌症在多个不同方面具有区别于正常细胞的特征，这些特征使癌细胞能够存活、增殖和扩散。尽管不同类型的癌症通过不同的机制在癌症进展的不同时间点表现出这些特征，但它们都归因于癌细胞的基因组不稳定性和由免疫系统驱动的炎症病变，这导致肿瘤微环境发生改变，包括某些标志物和受体的过度表达。过度表达的标志物和受体包括整合素受体、表皮生长因子受体（EGFR）、神经纤毛蛋白-1（NRP-1）受体、转铁蛋白受体（Tf-R）、蛋白酪氨酸磷酸酶受体型 J（PTPRJ）、去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）、低密度脂蛋白受体相关蛋白 1（LRP1）、胰岛素样生长因子 1 受体（IGF1R）、血管内皮生长因子（VEGF）等。在过去的几十年里，利用筛选技术开发出了专门与这些标志物和受体结合的肽，并且在肿瘤靶向诊断和治疗中得到了广泛应用。
整合素是细胞黏附分子的一个亚类，它将细胞骨架与细胞外基质（ECM）蛋白或其他细胞连接起来，并作为双向信号分子介导内向和外向信号传导。整合素是异二聚体，由两个基因上无关联的亚基组成，即α亚基和β亚基，它们作为细胞锚定和信号分子发挥作用。有 18 种α亚基和 8 种β亚基，可组合成 24 种不同的受体，具有不同的结合特性和不同的组织分布。整合素αvβ3，也称为玻连蛋白受体，在肿瘤新生血管和包括胶质母细胞瘤、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌在内的各种内皮癌细胞中高表达。通过精心设计，整合素αvβ3 结合肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）及其衍生物被装饰在纳米颗粒的外层，以主动靶向高表达αvβ3 整合素的癌细胞。基于这一策略，张及其同事使用了环 RGD 肽（环 RGD，cRGDfK），一种源自 RGD 肽的衍生物，作为靶向配体，用于负载美坦新衍生物的空心硫化铜纳米粒子（HCuS）的肿瘤靶向递送。所开发的纳米复合材料在近红外激光照射下，表现出理想的肿瘤靶向能力以及化学光热治疗和双模态成像（荧光和光声成像）特性。在另一个例子中，RGD 肽被修饰在负载抗癌药物阿霉素（DOX）和锰掺杂碳点（Mn-碳点）的介孔二氧化硅包覆金立方体-立方体核/壳纳米复合材料的表面，以增强光动力治疗和多模态成像（光热、荧光和磁共振成像）。采用这一策略，RGD 肽也被引入到介孔二氧化硅纳米粒子、金属有机框架（MOFs）、脂质体和其他诊疗纳米材料的表面，以实现对特定癌细胞的靶向。
整合素αvβ6 是另一种广泛用于癌症细胞靶向的受体。整合素αvβ6 在正常成年上皮细胞中不表达，仅在特殊伤口愈合条件下以及在癌症中表达。因此，靶向αvβ6 整合素不应影响正常组织，这在靶向治疗中是非常理想的。包括肺癌、结肠癌、乳腺癌和肝癌在内的多种癌症细胞会过度表达αvβ6 整合素。同时，整合素αvβ6 的上调通常与不良预后相关。因此，开发了几种特异性结合αvβ6 整合素的肽，并将其引入到诊疗纳米材料中。例如，Liu 等人将一种 21 氨基酸肽 HK（RGDLATLRQLAQEDGVVGVRK，HK 肽）引入到两种用于乳腺癌和胰腺癌治疗的诊疗纳米材料中。借助 HK 肽，诊疗纳米材料能够特异性靶向 4T1 小鼠乳腺癌和 BxPC-3 人胰腺癌。另一种与αvβ6 整合素结合的肽 A20FMDV2（NAVPNLRGDLQVLAQKVART）于 2018 年获批用于特发性肺纤维化（IPF）成像的 1 期临床试验，并取得了积极的结果。尽管作为成像或治疗系统中的靶向配体被深入研究，但这种20个氨基酸的肽很少被引入到诊疗一体化纳米材料中。
表皮生长因子受体（EGFR）是一组单链跨膜糖蛋白，属于受体酪氨酸激酶（RTKs）家族，包含四个成员：EGFR（ErbB1、HER1）、ErbB2（HER2、啮齿动物中的 neu）、ErbB3（HER3）和 ErbB4（HER4）。这些受体在调节细胞增殖、存活、分化和迁移方面发挥着关键作用。与 HER1、HER3 和 HER4 这三种受体不同，HER2 在许多癌细胞中高度表达，尤其是在某些乳腺癌中。此外，以 HER2 为结合位点的药物已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床。因此，HER2 被认为是开发诊疗一体化纳米材料的有前景的靶点。通过肽筛选技术，发现了一个 17 氨基酸的肽 P51（CDTFPYLGWWNPNEYRY），其在体外和体内对 HER2 均具有很强的亲和力和高特异性。作者还证明了 P51 肽可用作诊疗一体化纳米材料中针对 HER2 阳性细胞的靶向配体。
除了上述提到的靶向部位外，还有许多其他受体也被整合进了诊疗纳米材料中。例如，胶质母细胞瘤细胞归巢肽 T7（CHAIYPR）被修饰在载药金铁氧化物纳米颗粒的外层，通过鼻内给药用于胶质母细胞瘤的治疗。
与癌细胞类似，针对医疗需求也开发出了靶向肽。术后新生粘连的管理至关重要，而纤维蛋白是形成新生粘连的关键分子。因此，一种能特异性结合纤维蛋白的短肽 CREKA 被修饰成微泡，用于早期粘连的超声诊断和纤维蛋白的分解。在另一个例子中，RGD 肽被引入到负载钌的硒纳米颗粒（SeNP）诊疗纳米材料中，用于类风湿性关节炎的早期诊断和治疗。
3 环境响应肽
如上所述，癌细胞不稳定的基因组与炎症微环境使肿瘤微环境与正常组织区分开来。除了过度表达的标志物和受体外，病理性的肿瘤微环境还包括pH值、氧化还原梯度、酶浓度、氧分压和局部组织温度的变化。为了更好地利用这些偏差，开发了能够响应pH值变化、高氧化还原梯度、上调的酶和缺氧条件的肽。这些智能成分能够通过键断裂或结构变化对特定刺激作出反应，从而实现特定诊断和可控药物释放。
酶的高特异性和催化效率使生物体得以存在。因此，肿瘤微环境中上调的酶，如蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶和氧化还原酶，可能是癌症诊断和药物控制释放的理想靶点。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类锌依赖性内肽酶，在癌症侵袭和转移过程中降解细胞外基质蛋白。MMPs 主要由肿瘤周围的反应性基质细胞和炎症细胞产生，而非癌细胞。通常，MMP 响应肽是通过肽库筛选方法开发的可被切割的短肽序列。由于 MMP 在肿瘤进展中的作用，MMP 响应肽被引入到诊疗纳米材料中，并被用作诊断信号变化和药物释放的触发器。例如，MMP-2 响应肽序列 GPLGLAG 被引入到一种专门设计的“U 型”肽中，该肽在每个末端连接金纳米棒（GNRs）和原卟啉 IX（PpIX）。PpIX 的光活性最初被 GNR 淬灭。一旦它们到达过表达 MMP-2 的肿瘤部位，GPLGLAG 肽的裂解将释放出具有恢复荧光能力的原卟啉 IX，用于成像引导治疗。基于类似的理念，光诊疗剂原卟啉-a（PPa）通过 MMP-2 响应肽 PLGVR 连接到金纳米棒上，形成一种酶激活型诊疗剂，用于荧光成像引导的癌症治疗。一旦到达过表达 MMP-2 的肿瘤部位，PLGVR 肽的裂解将释放出 PPa，使其从淬灭状态中解脱出来并恢复荧光，用于成像引导的光热和光动力治疗。最近，MMP-2 可裂解肽 PLGVR 连接近红外（NIR）荧光团和荧光猝灭剂 QSY21，被附着到载有无机光热纳米盘的脂质体上，用于胃肿瘤成像和消融。同时，该复合物还负载了钆（Gd）用于磁共振成像（MRI）以及 cRGD 肽用于肿瘤靶向。在系统注射后积累到肿瘤部位，这些复合物在 MMP-2 触发下显示出显著的近红外荧光增强，可用于光热治疗的成像引导。
与 MMP 类似，半胱氨酸组织蛋白酶蛋白酶是内体和溶酶体中的关键水解酶，在多种肿瘤中高度活跃，通常与恶性程度增加和患者预后不良相关。Yoon 及其同事利用自猝灭的理念，将光诊疗剂 IR-780 连接到组织蛋白酶B可切割肽GFLG的两端，构建了一种用于癌症治疗的前药。在到达肿瘤部位之前，前药中的 IR-780 处于自猝灭状态，没有荧光或光毒性。在肿瘤部位，由过度活跃的组织蛋白酶 B 切割 GFLG 肽连接子后，荧光和光毒性得以恢复，用于癌症成像和光动力治疗。在另一项工作中，将含有组织蛋白酶 B 响应肽 Ac-FKC(StBu)AC(SH) 和 2-氰基苯并噻唑（CBT）基团的酶响应分子 Ac-FKC(StBu)AC(SH)-CBT 连接到上转换纳米晶体纳米平台上，以增强肿瘤部位的积累，并通过近红外成像进行癌症治疗。根据其设计，一旦纳米粒子到达肿瘤部位，酶响应分子就会被组织蛋白酶 B 水解，暴露出半胱氨酸中的游离 1，2-氨基硫醇基团，该基团很容易与 CBT 基序中的氰基发生缩合反应，从而触发交联纳米粒子在肿瘤区域的定位。
除了肿瘤部位过表达的用作诊断线索和药物释放触发器的酶之外，细胞凋亡过程中释放的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspases）也被用作治疗效果的指标。通过精心设计，酸性条件下易断裂的腙键将荧光抗癌药物阿霉素（DOX）和荧光团 5(6)-羧基荧光素（FAM）连接到强猝灭剂 Dabcyl 上，并通过可被 caspase-3 酶切割的肽 DEVD 形成用于癌症治疗和疗效评估的前药。此外，该前药还配备了 RGD 肽以实现肿瘤靶向。在肿瘤部位积累后，酸性环境释放阿霉素，导致癌细胞凋亡并发出红色荧光。随后，caspase-3 释放并切割 DEVD 肽，释放出 FAM 发出的绿色荧光。因此，该前药通过利用肿瘤微环境的异常和治疗诱导的酶释放，实现了药物释放的监测和治疗效果的评估。基于同样的理念，这些作者利用 DEVD肽作为敏感的连接体，用于监测光诊疗剂 PpIX 的释放，并随后评估其抗肿瘤疗效。
癌细胞的高代谢需求以及肿瘤血管的无序分布导致肿瘤微环境中质子的积聚，从而促进疾病的发展。除了腙类化合物，还开发了 pH 响应性肽来利用肿瘤区域的酸性环境。pH 低插入肽（pHLIPs）是一系列源自跨膜螺旋蛋白的肽。pHLIP 在酸性环境（pH < 7.0）下可溶于水，并能形成刚性螺旋结构插入细胞膜。基于此技术，Yan 及其同事将 pHLIP 肽（AEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGCT）与负载阿霉素的长余辉纳米颗粒（MSPLNPs）表面通过组织蛋白酶 B 响应性肽 GFLG 进行偶联。所得纳米复合物在肿瘤区域借助 pHLIP 的螺旋结构能够高效进入癌细胞，并通过 GFLG 肽的裂解释放阿霉素，用于肿瘤成像和化疗。
4 其他功能性肽
与用于增强跨膜递送的 pHLIP 肽类似，细胞穿透肽也被用于细胞内递送。Cheng 等人将细胞穿透肽 KALA（WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA）整合到载有阿霉素（DOX）和光热诊断剂吲哚菁绿（ICG）的肿瘤靶向牛血清白蛋白（BSA）纳米颗粒中，用于癌症成像和联合治疗。KALA 肽在体外和体内均表现出足够的跨膜转运能力。在小分子探针 Olsa-RVRR 中，细胞穿透肽（RVRR）通过 StBu 保护的半胱氨酸连接到具有奥沙替尼（Olsa）和 CBT 基序的共轭物上。除了作为广谱抗癌剂外，奥沙替尼还能通过水杨酸部分的羟基质子在化学交换饱和转移磁共振成像（CEST MRI）中提供明显的对比度。在 RVRR 肽的帮助下进入肿瘤细胞后，RVRR 部分和 StBu 保护基团会被弗林蛋白酶和谷胱甘肽（GSH）分离，引发半胱氨酸的 1,2-氨基硫醇基团与 CBT 基序的氰基之间发生生物相容性缩合反应，从而形成奥沙利铂二聚体。奥沙利铂二聚体将通过分子间 π-π 堆积自组装成奥沙利铂纳米颗粒。奥沙利铂纳米颗粒在细胞内的形成不仅提高了奥沙利铂的细胞内浓度，还延长了其滞留时间，从而导致增强的、局部化的化学位移转移磁共振成像（CEST MRI）信号和延长的药物暴露时间。此外，细胞穿透肽也被用于促进治疗诊断纳米材料通过血脑屏障（BBB）。
治疗性肽是从动物、植物和微生物等自然界中发现的一类肽，或者通过肽库筛选技术开发而来。与靶向肽类似，治疗性肽通过与受体结合发挥抑制剂、调节剂、激动剂或拮抗剂的作用。与蛋白质或抗体相比，治疗性肽具有易于合成、靶点特异性和选择性高以及毒性低等优点。目前已有近 50 种G蛋白偶联受体（GPCR）肽类药物获批用于临床，还有超过 10 种 GPCR 肽类药物正在进行临床试验。然而，稳定性差和半衰期短等缺点限制了其广泛应用。因此，在过去5 中，基于治疗性肽的诊疗纳米材料的报道有限。
5 结论与展望
随着对肽类生物活性和病理微环境的更深入理解，大量肽序列已被开发为功能性工具箱，赋予纳米材料诸如主动靶向、刺激响应和跨膜递送等特殊性能。多功能诊疗纳米材料得以实现，能够以最小的不良副作用完成更为复杂的生物医学任务。在过去 5 年中，基于肽的诊疗纳米材料主要集中在利用病理微环境实现特异性靶向和酶响应。尽管已取得令人鼓舞的成果，但值得注意的是，在许多情况下，诊疗纳米材料的功能成分在临床应用中未能发挥其最佳功能。主要原因有二：（1）诊疗纳米材料在病理区域按需聚集仍具挑战性；（2）诊断和治疗成分之间的协调难以平衡，因为它们针对不同的目的，具有不同的药代动力学和药效学特性。对于按需治疗诊断性聚集，除了延长循环时间以及寻找更有效的靶向配体外，还应考虑利用跨内皮细胞转运的策略，因为大多数纳米颗粒都是通过内皮细胞进入肿瘤的。同时，病理微环境触发的细胞内自组装等技术为积极聚集提供了新途径。至于诊断与治疗之间的平衡，可以开发针对需要频繁诊断的疾病状况的治疗诊断纳米材料，并结合家庭诊断技术，使患者能够方便地收集数据。或者，治疗诊断纳米材料可以作为研究工具，用于理解纳米药物的生物医学过程。可能，肽库的丰富、肽修饰策略的优化、对靶向递送的更好理解以及家庭诊断技术的发展，将为基于肽的治疗诊断纳米材料带来光明前景。
参考文献：DOI: 10.1002/VIW.20200050，作者：Lei Rong, Qi Lei, Xian-Zheng Zhang
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