酸敏感多肽作为递送载体, 或将其修饰在其他载体上, 负载药物后形成的纳米组装体可以在肿瘤组织中定点释放药物, 促进药物的细胞内化, 增强药物的治疗效果。目前发现酸敏感多肽种类较多, 多肽的氨基酸侧链、极性氨基酸数量、氨基酸序列及肽链二级结构都可以影响其酸敏感性。本文列举了近年来文献中报道的酸敏感多肽类型。

肿瘤组织具有特殊的糖酵解代谢过程, 从而形成微环境的弱酸性 (pHex 6.8), 而正常组织pHex及血液pH值均为7.4。因此, 酸敏感多肽在靶向递送抗肿瘤药物和基因的领域具有明显优势。酸敏感多肽对酸性环境高度敏感, 通过氨基酸残基侧链基团的质子化或去质子化, 影响多肽不同残基之间的相互作用并产生二级结构的构型变化 (如无规则卷曲和 α 螺旋之间的相互转变), 从而体现其酸响应性, 有利于酸敏感多肽自组装或修饰的纳米载体靶向释放药物或基因。

1 酸敏感多肽的结构特征

酸敏感多肽中的一些残基的侧链基团, 例如酸性氨基酸的羧基、碱性氨基酸的含氮官能团都具有质子化或去质子化的能力, 这些侧链基团的表面电荷的改变可以引起残基间作用力发生改变, 从而影响多肽的二级结构。

2 由氨基酸侧链基团引起的酸敏感

根据氨基酸侧链R基团的不同, 氨基酸可以分为3大类: 酸性氨基酸、碱性氨基酸和中性氨基酸。不同的碱性氨基酸侧链包含: 胍基、氨基或咪唑基, 对应的氨基酸分别是精氨酸、赖氨酸和组氨酸; 而酸性氨基酸的侧链都含有羧基, 如谷氨酸和天冬氨酸。常见的酸敏感氨基酸主要包括: 含有咪唑基团的组氨酸、含有氨基侧链的赖氨酸及含有羧基侧链的谷氨酸和天冬氨酸。当环境pH值从中性降至酸性时, 酸敏感多肽的这些残基侧链基团质子化, 影响静电相互作用, 从而使这些多肽具有酸敏感性。

2.1 由组氨酸侧链咪唑基团引起的酸敏感

在组成蛋白质的 20 种氨基酸中, 组氨酸归属于碱性氨基酸,其 pKa约为 6.5, 这是 pKa值唯一接近于 7.0的特殊氨基酸, 也是负责生物系统缓冲能力的主要氨基酸[。组氨酸在正常的生理环境下略带负电, 在 pH≤6.5时会发生质子化带正电。组氨酸的侧链咪唑基团在生理环境下既能释放质子又能接受质子, 同时还能与其他一些基团形成氢键。增加组氨酸或咪唑官能团已被证明是加强多肽酸敏感性的有效策略, 研究人员据此设计出许多含有组氨酸的酸敏感多肽。

TP10-5 (TK) [AGYLLGKINLKKLAKL(Aib)KKILNH2] 是 TP10 类似物中具有良好穿膜特性的穿膜肽(cell-penetrating peptide, CPP), 但其低特异性和较高的毒性限制了其应用于药物递送系统。为了克服 TK的不足, Zhang 等用组氨酸替换 TK 模板中所有的赖氨酸, 合成了一种新型的多肽——TH [AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHIL-NH2]。不同于 TK 模板, TH 的毒性显著降低, 且仅在低 pH 值条件下实现其穿膜特性,证实组氨酸的参与能使多肽链产生显著的酸敏感性。

在后续研究中, Zhang等设计了酸敏感多肽TH修饰的脂质体 TH-Lip。体外实验证明, 在 pH为 6.3的环境中 TH-Lip 的 zeta 电位由-4.8 mV 转变为 10.8 mV, 肿瘤细胞对 TH-Lip 的摄取明显增加, 且负载紫杉醇(paclitaxel, PTX) 的 TH-Lip 能显著抑制肿瘤细胞的生长; 在荷瘤小鼠中, 负载 PTX 的 TH-Lip 能很好地靶向富集于肿瘤组织, 显著提高 PTX 的治疗效果, 肿瘤生长抑制率达到 86.3%。以上实验证实, 当 TH-Lip 处于正常生理环境 (正常组织及血液循环中), TH的细胞穿膜特性被掩蔽; 当TH-Lip位于肿瘤组织外部的微酸性环境, TH组氨酸残基的咪唑基团质子化, 使得 TH-Lip表面电荷由负电荷转变为正电荷, TH 的穿膜特性被激活, 从而提高了肿瘤细胞对TH-Lip的摄取能力。此外, Shi等将TH的C末端连接环肽RGDfK, 合成了新的肽链 TR [c(RGDfK)- AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHIL-NH2], TR 不仅具有酸响应的细胞穿膜特性, 同时能够特异性识别肿瘤细胞表面过表达的整合素ανβ3,进一步增强了TH的靶向性。

Singh等发现组氨酸具有质子海绵效应, 能够通过增强内涵体逃逸来提高基因递送效率。Sun等以7 个组氨酸 (H7) 和 8 个精氨酸 (R8, 穿膜肽) 为亲水端,胆固醇为疏水端, 合成了一种两亲性酸敏感多肽(Chol -H7R8), 并用于多柔比星 (doxorubicin, DOX) 和质粒 DNA 的协同递送。由于共轭组氨酸的侧链咪唑基团的存在, Chol-H7R8不仅具有优良的穿膜性能, 同时兼具酸敏感性, 在酸性内涵体 (pHen≤6.5) 中, 通过质子海绵效应破坏内涵体膜, 释放 Chol -H7R8 负载的DOX和质粒, 实现高效的递送效果。

2.2 由赖氨酸侧链伯氨基团引起的酸敏感   

赖氨酸是一种碱性氨基酸, 也是20种氨基酸中唯一侧链含有伯氨基的氨基酸, 其pKa 约为9.2。本课题组设计出一种含有两个赖氨酸酸敏感两亲性多肽 [VVVVVVK‐KGRGDS], 以其自组装胶束作为抗肿瘤药物的递送载体, 该多肽自组装胶束的载药和释药过程如图 1 所示。选择 DOX 作为模型药物, 检测环境 pH 值的变化对自组装胶束的药物释放行为影响。结果显示, 胶束在中性介质 (pH 7.0) 中持续缓慢地释放 DOX, 而在酸性介质 (pH 5.0) 中, 胶束结构破坏, DOX 释放速度显著加快。由于整合素 ανβ3在肿瘤细胞表面的过表达, 将负载 DOX 的胶束与 HeLa 和 COS7 细胞同时孵育时, 多肽胶束可以有效利用 RGD 序列将 DOX 靶向递送到 HeLa 细胞中[30]。该两亲性多肽在其结构中含有 2 个赖氨酸残基、1 个精氨酸残基和天冬氨酸残基。2 个赖氨酸残基的氨基在酸性环境中可以质子化, 质子化氨基的量与游离氨基在pH 5.0的比例较pH 7.0时大约高100倍。氨基质子化加剧了两亲性多肽之间的静电排斥, 自组装胶束解体, 药物得以释放。

图 1 展示了两亲性肽 VVVVVVKKGRGDS 的 pH 响应性自组装示意图（a）以及两亲性肽自组装胶束中抗肿瘤药物的靶向释放示意图（b）。在靶向药物释放过程中，RGD 介导的内吞作用（1）促使癌细胞摄取两亲性肽（2）和抗肿瘤药物（紫色）胶束。在此内吞过程中，肿瘤细胞内的低 pH 值导致胶束裂解，并在癌细胞内迅速释放抗肿瘤药物（3）。进入细胞核（4）后，抗肿瘤药物可发挥其治疗作用，导致癌细胞凋亡（5）。

Schneider 等合成了一种含有 20 个氨基酸残基的肽 MAX1, 由疏水性的缬氨酸 (V) 和亲水性的赖氨酸 (K) 交替排列而成, MAX1 分子结构如图 2 所示。

研究发现, 在pH 5.5条件下赖氨酸氨基质子化, 赖氨酸残基之间的静电排斥作用使多肽 MAX1 以无规卷曲的形式存在; 通过NaOH将pH调节至9.0, 赖氨酸氨基去质子化, 多肽 MAX1则转变形成以缬氨酸残基为外层, 赖氨酸残基为内层的β-发夹结构, 并进一步自组装形成纳米纤维结构; 若将pH值再次调节至6.0, MAX1由β-发夹结构恢复至无规卷曲形式。多肽MAX1可逆的自组装过程显然是通过赖氨酸氨基质子化和去质子化调节的结果。此外, Dehsorkhi等设计出一种酸敏感两亲脂肽 (PA)C16-KTTKS。由于存在 2个赖氨酸残基和羧基末端, C16-KTTKS的极性头部在低pH值条件下带 2 个正电荷, 在 pH 7.0 时带有 1 个正电荷。PA 通过氢键、疏水缔合和静电作用的调节, 在不同 pH 值会形成不同的自组装结构, 如pH 2.0时, 能够自组装成球形胶束; pH 3.0时, 形成扁平的带状结构; pH 4.0时, 组装形成扭曲的右手螺旋结构; pH 7.0时, 这些扭曲的结构再次转变成扁平的带状结构 (β-折叠)。为了研究赖氨酸的含量对 PA 的二级构象和自组装行为的影响,Wan等将不同数量的赖氨酸残基加入到PA中, 合成了一系列的 PA 衍生物 (PA-Kn)。研究发现, 在酸性介质 (pH 1.0) 中, PA-K2的氨基被完全质子化, 带电荷的氨基基团增加了体系的亲水性, 并抑制了由于静电排斥而形成的 β-折叠。而在碱性条件下, 氨基因去质子化变得疏水性更强, 从而促进了分子间氢键相互作用和β-折叠的形成。

2.3 由谷氨酸侧链羧基引起的酸敏感 

谷氨酸的聚合物, 聚 (L-谷氨酸) 具有优异的生物相容性、无毒性和非免疫原性等生物学性能, 大量的侧链羧基可以用来修饰和调节pH值, 常用于药物递送和作为组织工程的生物材料。谷氨酸侧链上羧基的 pKa约为 4.1,在酸性 pH 条件下, 羧基以质子化形式存在, 疏水性增强; 而在中性pH下, 羧基去质子化, 成为可溶性的多肽分子。Chang等设计并合成了以 RGDSEEEEEEEEEEK为亲水端和以硬脂酸为疏水端RGDS-E10-Lys(C18) 的新型脂肽。如图 3 所示, 该脂肽能够形成由疏水性的硬脂酸核心和亲水性的 RGDS-E10外壳组成的自组装胶束, 环境 pH 值的不同会影响其自组装行为。透射电镜 (TEM) 测试显示, 在 pH 7.4 介质中, 该两亲肽可以形成均匀分散的自组装纳米胶束; 而在 pH 5.0介质中, 纳米胶束分解。圆二色谱 (CD) 结果也证实,在中性条件 (pH 7.4) 下, 多肽主要以无规卷曲的形式存在; 而在pH 5.0条件下, CD信号显著减弱, 脂肽的溶解度降低。此外, 采用疏水的DOX作为模型药物以评估酸敏感 RGDS-E10-Lys(C18) 的药物递送行为。在 pH7.4 和 pH 5.0 的介质中, 56 h 累积 DOX 释放率分别达到 51.7% 和 89.2%, 表明 RGDS-E10-Lys(C18) 胶束在酸性环境中能够更快速释放 DOX。抗肿瘤细胞实验也显示, 脂肽RGDS-E10-Lys(C18) 作为抗癌药物载体具有很大的潜力。

图 3 肽两亲分子的结构与胶束化

2.4 由天冬氨酸侧链羧基引起的酸敏感    

天冬氨酸与谷氨酸同为酸性氨基酸, pKa约为 3.9。多肽 pHLIP是一种含有天冬氨酸的36肽 (表1)。癌细胞表面的微酸环境能够触发 pHLIP 改变结构, 并插入到癌细胞的细胞膜上。pHLIP 在溶液中具有 3 种构象, 非结构单体 (状态I)、膜结合非结构单体 (状态II) 和膜插入单体 (状态III)。从状态II到III的转换是通过在酸性条件下天冬氨酸的羧基质子化形成 α-螺旋实现的。

pHLIP的跨膜部分含有两个天冬氨酸残基, 在生理pH值条件下羧基去质子化, 带负电荷的残基增加了多肽的亲水性, 阻止其进入细胞膜脂质双层的疏水区, 并起到了将多肽锚定到细胞膜表面的作用。而在酸性环境下, pHLIP 由于天冬氨酸的羧基质子化而且转变形成α-螺旋结构。此外, 由于形成较小的极性, 多肽pHLIP的疏水性增强, 增加了多肽对脂质双层疏水区的亲和力, 由状态II转变形成状态III, pHLIP的C末端穿过细胞膜, 形成稳定的跨膜 α-螺旋结构[39]。同时有实验证实, 用赖氨酸、丙氨酸或天冬酰胺取代天冬氨酸残基会导致多肽 pHLIP 的这种酸敏感穿膜特性的丧失。此外, 用谷氨酸取代 pHLIP 跨膜部分中的 1 个天冬氨酸会提高触发状态转变的pH值 (由6.0提高至6.5); 若用谷氨酸取代 2 个天冬氨酸则导致肽的聚集性增强, 在中性 pH 下多肽会聚集在脂质双层表面[37,40]。在药物递送的应用中, 研究者发现 pHLIP 比较适用于递送极性较强, 无法穿透细胞膜的药物。通过改变负载药物与pHLIP的连接方式或将调节性分子连接到多肽的插入端, 可以进一步促进极性较强药物的细胞内化。此外, 对于依赖被动扩散的药物分子, pHLIP相关的递送系统不仅可以显著增加药物在血液中的保留时间, 同时会提高针对肿瘤组织的靶向性。Wei等也通过引入pHLIP, 增强了超顺磁纳米颗粒的肿瘤靶向性, 并实现了体内肿瘤组织的核磁共振诊断, 进一步验证了pHLIP 优良的酸敏感特性。此外, 为了更好地理解和运 用 具 有 酸 敏 感 性 的 多 肽 pHLIP, Wyatt 等根 据pHLIP的穿膜区构建了一系列的突变体 (表1), 其中包括利用两种非天然氨基酸 (Gla和 Aad) 替换天冬氨酸的 pHLIP/Gla 和 pHLIP/Gla/Aad; 截短的 pHLIP 类似物 (pHLIP/Var3、pHLIP/Var3/Gla 和 pHLIP/Var3/GLL)及从头设计的酸敏感多肽 ATRAM, 表征了它们的酸敏感特性并验证了药物递送应用效果。结果表明, 在这些 pHLIP 的突变体中, 与 pHLIP 相比, Gla替代的突变体 (pHLIP/Gla) 的肿瘤靶向性有所降低。但突变体pHLIP/Var3在酸性环境诱导下, 具有更快的状态转变速度, 从而更早形成稳定的跨膜α-螺旋结构, 而且在不同的浓度范围都能表现持续稳定的结果。

表1：酸敏感肽及其序列。Y* 代表氨基酸 3,5-二碘酪氨酸

3 总结：

鉴于肿瘤微环境及内涵体的弱酸性, 酸敏感多肽自组装或修饰的纳米药物递送系统已被证明是一种有效的治疗策略。但由于诱导酸敏感多肽结构改变的 pH 值普遍小于 6.5, 增强内涵体逃逸是目前更为现实的研究目标。因此, 更多研究者将酸敏感多肽与其他靶向性配体共修饰纳米药物递送系统,以实现更高效的肿瘤组织靶向性。

参考文献：DOI: 10.16438/j.0513-4870.2018-0799

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