肽类氟化方法及其新兴特性

含氟配体和氨基酸的可得性及多样性，再加上获取非标准残基的合成方法易于实现，这些因素使得人们对于开发用于生物有机应用的含氟序列的兴趣大增。众多研究已表明，在生物聚合物中引入吸电子的氟取代基，能够从分子内影响肽骨架中功能基团的化学环境，并通过氟-氟相互作用直接增强分子间的长程组织能力。实际上，仅仅改变序列中一个氟原子的位置，就能显著改变肽链的疏水性、两亲性和二级结构。

尽管肽类化合物的氟化会产生许多有利的性质，但将氟原子引入这类生物聚合物所产生的影响难以预测，且很大程度上仅限于经验性的公式化方法。最近，Koksch 及其同事开始系统地确定结构与性质之间的关系，并开发设计原则以合理地设计含氟肽骨架。将氟原子引入肽类化合物通常有三种策略：(a) 引入非天然的含氟α-氨基酸；(b) 连接含氟烷基侧链；(c) 对肽链主链进行氟化，如图 2 所示并将在下文讨论。

图 2 左侧，含氟氨基酸可通过固相技术轻松整合到非天然序列中。图中展示了常用的含氟残基示例。中间，连接到肽链末端的氟代烷基基团能够促使天然序列产生独特的组装现象。右侧，环肽的主链氟化可提高环化效率，有助于调整分子构象，并通过氟效应增强自组装。

非经典的含氟氨基酸是合成非天然肽和蛋白质的宝贵工具。与天然氨基酸相比，含氟变体通常具有更高的稳定性、更强的折叠能力和可编程的生物活性。目前市面上已有多种在侧链中至少含一个氟原子的烷基、环状和芳香族氨基酸。Koksch 等人最近对用于合成氟化α-氨基酸的立体选择性合成方法进行了全面综述。 Koksch 团队还开发了流体合成方法，可快速合成消旋氟化α-氨基酸，且无需固相技术中常用的保护基团。最近还报道了能生成高度氟化的β-氨基酸的对映选择性反应。如今，这些含氟的α-和β-残基的引入已被广泛用于控制组装序列的超分子形态，从而形成圆柱形纳米纤维、带状物、卷曲螺旋、低聚物、纳米颗粒、纳米孔等。有趣的是，这些由含氟序列的疏水性增强所导致的含氟模板组装现象，最近已被用于开发针对阿尔茨海默病中β-淀粉样蛋白（Aβ）低聚化的肽抑制剂。将19F标记的氨基酸引入序列中，也已被用作一种光谱学手段，以探究肽的构象动力学。这使得研究人员能够利用氟核磁共振（NMR）来研究 19F 标记的肽在其环境中的相互作用，包括研究溶剂化效应驱动抗菌肽活性、膜结合状态下的细胞穿透肽以及用于药物发现的配体-蛋白质生物物理学。还开发了带有 19F 氨基酸的非天然肽作为定量磁共振成像探针，这在本文后面会有更详细的讨论。

将氟原子引入肽的第二种被广泛采用的方法是将含氟烷基尾接枝到自组装序列上（图 2 中间）。由此产生的两亲分子可以被编程以组装成一系列结构状态，包括圆柱体和带状结构，这一过程由氟-氟寡聚化介导。斯图普和米德通过将全氟化的7或8碳疏水尾接枝到由含C末端带电残基（Lys2、Lys3 或 Glu2、Glu3）的 Val2-Ala2 支架变化而成的序列上，对这种方法进行了例证。这些带电的肽两亲分子被设计成响应不同的钙浓度和环境 pH 值进行超分子组装，以优化 19F MRI 信号。有趣的是，pH 值从 4.5 升高到 8.0 时，C7-Val2-Ala2-Glu2 组装态从β折叠带状纳米结构转变为圆柱纤维，同时磁共振信号相应增强。全氟烷基尾也已被接枝到肽树枝状大分子上，以促进其组装成大于 100 纳米的寡聚聚复合物，并增强其细胞摄取和溶酶体逃逸特性。

作为含氟疏水尾和氨基酸的替代方案，其他研究小组选择将氟原子引入环肽的主链，以微调其构象状态（图 2，右）。以常用的生物活性配体环 RGD为模板，Au 及其同事利用立体选择性氟化来影响环肽的二级结构和生物活性。例如，质谱和核磁共振研究表明，主链含氟的γ-氨基酸的引入会增强或降低肽的环化效率，这取决于氟原子诱导的形状，并且能够获得具有独特顺反构象的新型高能几何结构。因此，这些由氟原子诱导的分子排列对人微血管内皮细胞（HMEC-1）的结合、铺展和血管生成潜力产生了显著影响；与非氟化的环 RGD 对照相比，氟化类似物通常会抑制生物反应。在另一项研究中，对环化四肽和六肽进行主链氟化处理，形成了自组装纳米管，这些纳米管可用作跨膜阴离子选择性转运体。在这里，氟原子的添加诱导了反向转角，促进了β-折叠构象和管状组装，最终使α，γ-环己肽纳米管（EC50 = 2.14 μM）的转运效率优于α，γ-环四肽类似物（EC50 = 14.75 μM）。

最后，尽管超出了本综述的范围，但值得注意的是，全氟溶剂对肽二级结构和组装现象的影响早已为人所知。例如，诸如 2,2,2-三氟乙醇和六氟异丙醇之类的含氟醇几十年来一直被用于促进和稳定α-螺旋和β-发夹构象。同样，通过在疏水性全氟离子聚合物表面模板化弹性蛋白样肽的组装，也实现了相分离的薄膜电极。

氟肽纳米和微米组装

将含氟基团引入肽序列的不同方法，旨在诱导或增强其自组装，能够生成形态各异、尺寸不同的纳米和微米结构。所得自组装状态高度依赖于含氟肽的设计，并受诸如：含氟基团在肽中的位置；非天然氨基酸的数量或引入序列中的氟代烷基链的长度；以及疏水或亲氟环境的存在等因素的影响。这些方面共同作用，使含氟肽形成三种主要的纳米和微米层次结构：（a）球形颗粒，（b）纤维状集合体，以及（c）圆柱形支架。

在上段中介绍了将氟原子引入肽序列对分子间组装以及向高度稳定的纳米和微米级结构演变所产生的显著影响。在大量溶液中实施这些氟化方法可使超分子纤维发生长程缠结，从而用于制备宏观水凝胶。在本节中，我们将阐述使用含氟凝胶剂单元如何提高宏观组装速率以及通过氟的封存提高水介质中的效率，最终增强所得水凝胶结构的机械性能，并赋予其无与伦比的蛋白水解和热稳定性。基于含氟肽的水凝胶组装通常采用两种方法：（a）在 Fmoc 基肽中引入非天然的含氟苯丙氨酸；（b）用五氟苯（PFB）对天然残基的 N 端进行修饰。