靶向肽是少于50个残基的氨基酸序列，可能是天然存在的，也可能不是。由于其分子量低且结构简单，靶向肽通常比抗体具有更好的组织渗透性，并且还表现出高稳定性、低免疫原性和易于操作的特点。这些特性使得肽在分子成像和癌症诊断及治疗的靶向药物递送系统中被广泛用作配体。此外，一些肽已被证明可通过与细胞表面受体结合直接抑制肿瘤生长和转移。因此，肽在基础研究和转化医学中具有很高的潜力。随着靶向肽开始在肽介导的药物递送系统和成像模式中被广泛用作配体，这种潜力正在逐渐实现。该领域的近期成功激发了更多旨在识别可用于各种临床问题的新型靶向肽的研究。
靶向肽通常从三大来源中获得：（i）来自植物和动物的天然配体或其类似物；（ii）化学合成产物；（iii）噬菌体展示肽库。通过天然配体或其类似物（仿生学）的鉴定或天然产物或合成组合库的筛选，已发现大量靶向肽。利用库筛选能够从大量且多样的肽库中高效地识别出靶向配体。噬菌体展示是最常见的生物展示肽库类型，还包括 mRNA 展示、核糖体展示、细菌展示和酵母展示。此外，合成肽库，如 OBOC（一珠一化合物）库、肽核酸（PNA）编码的溶液相肽库、肽微阵列和位置扫描肽库也已被用于靶向配体的发现。下面我们将讨论靶向肽的三大来源，并提供每类中成功鉴定出的配体实例。
1 天然配体与生物模拟物
一种靶向肽的发现方法是利用天然肽，这些天然肽源自已知能够与目标受体结合的内源性蛋白质，作为感兴趣的细胞表面分子的特异性配体。这些天然配体或仿生肽通常与目标受体具有高亲和力和特征明确的相互作用。在癌症应用中，受体应仅在癌细胞或癌相关血管表面高表达，才能被视为靶点。目前使用的靶点大多来自三类主要受体：整合素、生长因子受体和 G 蛋白偶联受体（GPCR）。这些细胞表面分子类别为抗癌疗法提供了有吸引力的靶点，因为它们常常参与肿瘤生长和恶性转化。已有多项研究报道了天然肽在肿瘤靶向中的应用。例如，生长抑素受体属于GPCR超家族中的一个独特类别。生长抑素在生理条件下与这些受体结合，以负向调节细胞功能，如下丘脑中生长激素的释放。已报道多种不同类型的肿瘤会异常高表达生长抑素受体，尤其是神经内分泌源性癌症，包括小细胞肺癌（SCLC）、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤和乳腺癌。然而，野生型生长抑素十四肽由于其极短的半衰期（1 至 3 分钟），难以用于诊疗应用。因此，科学家们设计出了模拟肽，这些模拟肽相较于野生型肽更耐酶切，且在体内循环时间更长。在这些模拟肽中，帕瑞肽（商品名：Signifor）已在美国和欧洲获批用于库欣病的治疗。目前，帕瑞肽正在针对晚期肺和胸腺类癌患者开展 II 期临床试验，并且 177镥-DOTA 放射性标记药物已被用于肿瘤的分子成像。
促黄体生成素（LH）-促黄体生成素释放激素（LHRH）是一种下丘脑神经肽，通过作用于下丘脑-垂体轴来发挥生殖的中枢调节作用。在大多数人类黑色素瘤以及子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌和乳腺癌中，LHRH 受体均被发现过度表达，而在正常组织中则很少表达。从机制上讲，LHRH 可能作为生殖系统肿瘤的生长调节因子发挥作用。一些 LHRH 类似肽已被发现并用于癌症治疗。例如，LHRH 肽类似物 AEZS-108 靶向 LHRH 受体，并与阿霉素偶联；该肽对癌细胞具有细胞毒性。该药物的 III 期临床试验正在进行中。
通过筛选噬菌体展示文库（其中人类 cDNA 文库得以表达，肽片段展示在噬菌体丝状体上）有可能发现具有肿瘤归巢能力的天然肽。在利用该技术的一个成功案例中，Porkka 等人对体外培养的骨髓细胞进行了噬菌体展示 cDNA 文库的筛选，随后在荷瘤小鼠中进行了实验。作者鉴定出了F3 肽，这是 HMGN2 蛋白结构域的一个 31 个氨基酸的片段，它能与肿瘤细胞和血管生成内皮细胞表面的核仁素结合。自其被发现以来，F3肽已在细胞和动物模型研究中被用作向肿瘤细胞递送治疗分子的载体。
其他天然靶向肽是从负责细胞间黏附的分子中衍生出来的。整合素由一个α亚基和一个β亚基组成，是异二聚体跨膜蛋白，能与细胞外基质（ECM）中的蛋白质相互作用，包括纤连蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）三肽是整合素的核心结合基序，存在于多种细胞外基质蛋白中，如玻连蛋白和纤连蛋白。RGD 于 20 世纪 80 年代初由 Ruoslahti 和 Pierschbacher 首次描述，目前，经过充分研究的 RGD 肽已成为生物材料应用中最常用的靶向肽。因此，经过小分子药物、siRNA、纳米颗粒或同位素功能化的合成 RGD 肽已被用作肿瘤诊疗中的靶向配体。值得注意的是，一种环四肽（RGDfV），即西仑吉肽，能够结合并抑制 αvβ3整合素，从而阻断肿瘤血管生成。该药物在治疗胶质母细胞瘤患者的 III 期临床试验中进行了研究。然而，试验失败了，因为将西仑吉肽添加到标准治疗中并未提高新诊断胶质母细胞瘤患者的总体生存率。
2 噬菌体展示肽库筛选
噬菌体展示肽库由众多噬菌体克隆组成，每个克隆都编码一段外源 DNA 片段，用于在噬菌体颗粒表面表达异源肽。外源肽通常与丝状噬菌体的 pIII 或 pVIII 蛋白的 N 端融合。当前的噬菌体展示系统包括 M13、T7、T4 和 f1，这些系统的选择依据是噬菌体载体的特定特征。其中，M13 丝状噬菌体由于其在 DNA 文库克隆方面的灵活性以及易于繁殖而被最广泛使用。T7 裂解噬菌体虽然在噬菌体展示中使用较少，但与 M13 噬菌体库相比，其序列偏差更小、稳定性更高，更适合表达较长的肽（12 - 20 个氨基酸）。噬菌体展示技术具有以下优点：（i）可生成规模巨大的文库（1010 个克隆），且肽序列多样性高；（ii）市面上已有成熟的随机肽库和构建套件，例如 T7Select 噬菌体展示系统（默克公司）以及 PhD-7、PhD-12、PhD-C7C M13 噬菌体库（新英格兰生物实验室）；（iii）筛选板价格低廉、高效且易于根据大多数实验室的具体需求进行调整；（iv）噬菌体宿主生物大肠杆菌易于使用，能够快速扩增噬菌体文库。然而，这项技术最值得注意的优势在于噬菌体展示技术基于表型（展示的肽）和基因型（编码 DNA）之间的内在联系，从而能够在单次反应中筛选数十亿个克隆。噬菌体展示肽库可用于多种应用，包括选择与受体或蛋白质结合的生物活性肽、鉴定疾病特异性抗原的模拟肽，或者选择与非蛋白质靶点、完整细胞或活体生物中的特定组织结合的肽。
亲和选择肽与特定靶点结合的过程称为生物淘选，可在体外、体内或体外培养的基质上进行（图 16.1）。一般来说，生物淘选程序包括几个关键步骤：（i）将噬菌体文库与靶点孵育，（ii）进行大量清洗以去除非结合或弱结合的噬菌体，（iii)用酸或高盐溶液洗脱特异性结合的噬菌体，在宿主细菌细胞中通过扩增来富集噬菌体。通常要进行三到五轮生物淘选来富集噬菌体库，最终获得表达具有高结合特异性和活性肽的噬菌体。然后通过单个噬菌体克隆的 DNA 测序来确定所选噬菌体的肽序列。总体而言，这种方法使科学家能够轻松发现与特定靶点特异性结合的肽配体。然而，在使用新靶点进行生物淘选时，有几个参数需要进行微调。例如，第一步中使用的噬菌体克隆数量、去除非特异性结合的噬菌体、选择和洗涤的严格程度以及竞争洗脱等都应进行优化。
图 16.1 通过噬菌体展示文库筛选选择靶向肽。在噬菌体上展示的随机肽库可用于多种靶标，包括纯化的蛋白质、癌细胞或活体小鼠中的组织。经过三到五轮生物淘选后，选择出特定的噬菌体克隆，并通过酶联免疫吸附测定（ELISA）或流式细胞术进行分析。通过 DNA 测序可确定靶向肽的序列。
噬菌体展示肽库在B细胞表位图谱绘制中一直被广泛应用。B细胞表位的鉴定对于抗体开发而言是必要且有价值的。原则上，表位分为线性和构象性两类。线性表位通常由蛋白质序列中连续或非常接近的氨基酸组成，而构象性表位则可能由蛋白质一级结构中相距较远的氨基酸组成。由于噬菌体展示技术能够以库的形式展示多种不同的肽，因此在表位图谱绘制应用中得到了广泛使用。噬菌体展示技术更适用于线性表位的鉴定，但也有文献报道其可用于构象性表位的鉴定。
在过去的几十年里，与癌症相关的膜蛋白、癌细胞系以及肿瘤相关内皮细胞已成为噬菌体展示技术筛选靶向肽的主要目标。迄今为止，研究人员已鉴定并表征了针对多种癌症类型的众多靶向肽，包括乳腺癌、肺癌、肝癌、脑癌、胰腺癌、结肠癌和血液系统癌症等。最近，癌症干细胞（CSCs）或癌症起始细胞被表征为具有高度致瘤性的细胞亚群，与耐药性、癌症转移和癌症复发相关。因此，CSCs 现在也被认为是选择特定靶向肽配体的有吸引力的目标。为此，从噬菌体展示的随机肽库中已鉴定出针对结肠癌、乳腺癌和脑癌 CSCs 以及 CSC 相关表面标志物 CD44 和 CD133 的特异性肽。目前认为，细胞表面的聚糖是癌症细胞或肿瘤干细胞（CSCs）的生物标志物，可能对诊疗具有重要价值。从M13噬菌体展示文库的筛选中已鉴定出靶向小鼠和人类CSCs的肽。Su 等人发现，肽CSC HP-1 和 CSC HP-hP1 能与CSCs结合，并且与微阵列芯片上偶联的 Globo 4 和 Lewis Y 聚糖表位，或与牛血清白蛋白偶联的 Globo 4 和 Globo H 具有很强的关联性。
以活细胞作为生物淘选靶标是一种广受欢迎的策略，具有诸多优势：（i）无需构建和纯化重组蛋白；（ii）可直接鉴定细胞表面结合的肽；（iii）细胞表面分子的构象和拓扑结构更接近天然状态；（iv）易于发现具有生物功能的肽（例如受体激动剂和拮抗剂）。此外，噬菌体展示技术在体内生物淘选中用于寻找组织或器官特异性肽也得到了广泛应用。鲁奥萨利蒂及其同事于 1996 年首次描述了这种体内噬菌体展示技术。作者试图利用噬菌体展示肽库发现靶向脑血管的肽。通常，在体内筛选时，通过静脉注射将随机肽噬菌体库引入动物的血液循环。经过短暂的循环时间（通常为 5 至 15 分钟），处死动物，通过左心室用生理盐水灌注将未结合的噬菌体克隆冲洗掉。收集所需的组织或器官并进行匀浆，之后通过感染大肠杆菌从匀浆组织中回收结合的噬菌体。这种通用方法已应用于识别能选择性识别多种不同器官的肽，包括脑、肾、肺、肝、子宫、肌肉、胰腺、胸腺和乳腺。
针对各种类型肿瘤细胞和肿瘤相关血管的靶向肽已通过噬菌体展示的体内生物淘选法进行了广泛研究。近年来，患者来源的异种移植（PDX）模型已得到开发，即在免疫缺陷小鼠体内移植患者的肿瘤组织。这些模型在临床前癌症研究和药物筛选中已得到广泛应用。PDX 模型的一个主要优势在于其能真实地复制原始肿瘤微环境。因此，未来针对靶向肽的体内筛选可能会利用这些模型，而非传统的异种移植小鼠模型。另一个有趣的筛选目标是肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），最近有报道称其参与肿瘤免疫抑制、血管生成、转移和复发。Scodeller 等人在携带 4T1 转移性乳腺肿瘤的小鼠体内进行了体内肽噬菌体展示筛选，以识别靶向腹膜巨噬细胞的肽。他们发现了一种肽UNO，其通过 CD206 曼糖受体选择性识别表达 MRC1 的 TAMs。
药物向大脑的运输受到血脑屏障（BBB）的限制，这阻碍了许多脑部疾病的治疗，包括阿尔茨海默病、帕金森病和脑癌。为了克服这一限制，人们利用噬菌体展示的随机肽库来识别血脑屏障靶向肽配体。通过模拟血脑屏障特性的体外人类细胞模型，已鉴定出 SGV 血脑屏障穿梭肽。这些肽通过网格蛋白介导的内吞作用被内皮细胞内化。噬菌体展示技术还在小鼠灌注模型中用于发现能够识别自然生理系统中脑内皮细胞的靶向肽。Martinez 等人建立了一种自身免疫性心肌炎的动物模型，并通过体内荧光成像的噬菌体展示筛选，鉴定出了潜在的靶向肽 MyH-PhD-05 和 MyH-PhD-120。肽 MyH-PhD-05 能够检测出患有严重心肌炎的动物，即使在功能未发生改变的情况下也能检测到。这一特性表明该肽在心肌炎的诊断方面具有很高的潜力。
已建立了多个互联网数据库来对实验验证过的肿瘤靶向肽进行分类，并提供免费的搜索服务。例如，CPC scientific 是由 TumorHoPe 改编而来，还有 CancerPPD以及由癌症研究所（CRI）构建的 CRI 数据库。然而，数十种靶向肽通过活细胞和动物模型的噬菌体展示生物淘选所发现的那些分子，其结合伴侣尚不明确，因此需要进一步表征。
3 合成肽库筛选
另一种类型的库被称为合成肽组合库，已被用于识别能特异性靶向细胞表面的肽。与噬菌体展示不同，噬菌体展示将库的成分限制为具有天然氨基酸（L-氨基酸）和简单肽结构的肽，而合成肽库可以由具有天然和非天然氨基酸（D-/α-/β-/γ-氨基酸）以及非典型结构构象（例如线性、环状或分支）的肽组成。已经开发出了几种类型的合成化学库，例如 OBOC 库、PNA 编码的溶液相肽库、肽微阵列和位置扫描肽库。这些库的灵活性可能会增加找到具有良好的稳定性、亲和力和特异性，适用于药理学和分析用途的新靶向肽配体的机会。
Lam 等人首次报道了使用 OBOC 技术快速构建包含数百万种肽的随机文库以鉴定靶向配体。在过去的几十年里，这种方法一直是合成文库中用于筛选配体的最流行方法。OBOC 文库的构建基于在具有亲水表面层的单个固体珠（如 TentaGel 树脂）上进行单个化合物的组合合成。肽的合成采用标准的固相肽合成方法，包括芴甲氧羰基（FMOC）化学和分组混合。每个单独的珠子（直径 80 - 100 微米）以高浓度（约 100 皮摩尔）展示一种肽。除了天然和非天然氨基酸外，OBOC 文库中还可以包含具有翻译后修饰的肽，例如 N-甲基化肽、磷酸肽和糖肽，这些已被用于靶向配体的筛选。
Kodadek 及其同事报道了一种方法，该方法利用固定化链霉亲和素的量子点来视觉检测生物素化蛋白与 TantaGel 珠表面展示的肽段的结合，量子点的荧光可在此过程中被轻松观察到。链霉亲和素-马来酰亚胺过氧化物酶在市面上有售，并且在另一种流行的筛选方法中也被用于催化比色读数。对于这两种方法，结合了目标物的珠子必须在显微镜下通过手动移液管进行挑选。通常，由于珠子直径过大，流式细胞术不适合对命中珠子进行分选。因此，筛选命中珠子以获取目标蛋白或完整细胞的过程既耗时又低效。不过，Cho 等人开发了一种使用复杂对象参数分析和分选仪（COPAS）大颗粒生物分选仪对结合了人类细胞群的珠子进行高通量分选的方法。作者用 OBOC-RGD 库对表达 αvβ3 整合素的人类癌细胞进行了筛选，然后通过 COPAS 仪器快速分选了珠子-细胞复合物。命中珠子上的肽序列随后通过 MALDI-TOF 质谱进行解码。
科达德克及其同事描述了一种实验平台，该平台将大规模并行的基于磁珠的 OBOC 库筛选与基于微阵列的方法无缝结合。该方法采用与次级抗体偶联的顺磁性氧化铁颗粒，借助强磁铁高效去除假阳性（非特异性）的命中磁珠。同一研究小组还设计了一种磁筛选方案，利用抗 FLAG 抗体和显示在 TentaGel 磁珠上的 FLAG 肽表位来探测亲和力较低的抗体 - 配体相互作用。
通过完整癌细胞或细胞表面受体的细胞外结构域进行 OBOC 文库筛选，可以找到靶向肿瘤细胞的配体。通常，通过筛选完全随机的肽库来找到初步的肽候选物。随后通过设计和筛选包含初步候选物保守基序的聚焦文库来实现先导物优化。在显微镜下手动收集阳性珠子或使用 COPAS 设备自动分选。然后直接通过 Edman 降解法或质谱法测定肽序列。王等人将 OBOC 文库与硅基微阵列系统相结合，开发了颜色编码肽，以发现高亲和力靶向肽。利用该技术，他们成功地鉴定了新型肽配体 H1P 和 H2P，它们分别以纳摩尔亲和力与 HER1 和 HER2 结合。除了癌细胞系外，OBOC 文库方法还可用于从临床样本（如血液、胸腔积液、腹水或活检标本）中鉴定针对癌细胞的靶向肽。
其他合成肽库也被用于筛选靶向配体。此类筛选的一个目标是肽转运蛋白 1（PEPT1），它是肽转运蛋白家族的一员，在小肠、肾脏和胆管的上皮细胞以及胰腺细胞核中均有表达。重要的是，在一些人类癌细胞系中观察到了 PEPT1 的过表达，包括 AsPC-1 胰腺癌细胞系和 HT1080 纤维肉瘤细胞系，并且先前的研究表明 PEPT1 是抑制癌细胞的一个有用靶点。为了靶向 PEPT1，研究人员基于模型药物叠氮胸苷（AZT）构建了一个二肽药物偶联库。通过配体竞争法，从该库中筛选出了一个与 PEPT1 特异性结合的丝氨酸-谷氨酸二肽（DIP）。将 DIP 与有机荧光染料、纳米颗粒或药物偶联，使得这些载荷部分能够轻易地被肿瘤细胞内化。
肽微阵列是发现靶向肽的有效筛选平台，并为抗体表位的鉴定提供了独特的机会。通常，肽微阵列通过原位合成、原位固定或化学偶联的方法在各种固体表面（包括载玻片、纤维素片、聚合物膜和微芯片）上打印肽阵列。科学家们已利用肽微阵列快速进行筛选实验，以鉴定固定化肽与细胞或蛋白质之间的分子相互作用。不同的肽长度和构型可以整合到阵列芯片中，以构建具有高结构多样性的文库。因此，可以揭示靶向肽的最小结合序列和关键氨基酸残基。与其他组合文库不同，肽微阵列能够实现高通量筛选，且易于操作。
芯片上固定肽的氨基酸序列和位置事先已知，这是该技术的一大优势。构建肽微阵列最常用的方法是从已知蛋白质中改编序列。最近，利用半导体制造中常见的设备，该技术已扩展到每张硅片上可容纳数百万种肽。然而，与噬菌体展示技术相比，阵列上的肽数量相当少。这种文库成分数量少是该方法的主要缺点，限制了其在高通量筛选中的应用。另一个使用障碍在于，固体平面表面可能会改变阵列上肽的构象，导致真正底物的结合亲和力测量值偏低，或者增加假阳性结合的风险。
邦焦尔诺（Bongiorno）团队及其同事设计了一种很有前景的方法，该方法将高效载玻片与肽微阵列相结合，用于鉴定能与β-淀粉样蛋白（Aβ）单体结合的小肽。该技术具有高灵敏度和低样本消耗的特点，表明其在阿尔茨海默病药物研发中的分子谱分析方面会很有效。此外，小崎（Kozaki）等人应用光可裂解肽阵列技术分析了可溶性肽，并鉴定出能抑制α-淀粉酶活性的靶向肽。该团队还进一步构建了一种新型筛选系统，用于选择具有细胞内功能的肽，最终从细胞凋亡诱导肽（LNLISKLF）在 Noxa 蛋白的线粒体靶向域中鉴定出几种能诱导体外乳腺癌细胞死亡的新肽。
4 总结
近年来，将肽类物质用作治疗药物的兴趣日益浓厚，目前已有超过 68 种肽类药物上市，另有 155 种肽类药物正在临床试验中。目前推动肽类药物治疗应用的主要领域是代谢疾病和肿瘤学。肽类药物筛选和计算生物学方面的当前及未来改进有望继续扩大肽类药物的潜在应用范围，而肽类药物递送、制剂以及延长半衰期方面的进展将提高肽类治疗药物的疗效。
