在本综述中，我们重点关注这些化合物，并阐述了开发高效肽-药物偶联物的重要因素。文中描述了肿瘤靶向肽所必需的特性，讨论了用于连接毒性药物和肽的不同可切割连接子的选择，并报告了引入这些结构的合成考虑因素。

两个实体之间化学键的可控断裂是一种重要特性，有助于调节化学功能团的释放，以用于合成应用，或者在化学生物学中选择性地释放分子以发挥特定的生物学功能。可裂解的连接结构在固相合成小分子和组合化学中有着悠久的历史。它们将正在生长的有机分子连接到固相载体上，从而能够使用过量的试剂，并通过过滤轻松纯化粗产物，从而在合成过程中获得高产率。此外，它们在合成过程中需要保持稳定，并在特定条件下释放分子。这一概念在固相肽合成中得到了最复杂的应用，其中使用不同的可裂解连接体和多种保护基团，能够合成具有多种修饰的多肽，用于生物应用。不幸的是，固相合成中用于裂解这些连接体的苛刻条件不允许它们直接用于生物应用。因此，人们已经设计出了能在生物相容条件下特异性裂解的化学基团。通过特定的功能基团，可裂解连接子的概念在许多不同的生物化学领域中应运而生，如蛋白质纯化、蛋白质组学、成像，以及药物发现，尤其是选择性药物递送系统的开发[。这些系统是靶向治疗的基础，尤其在癌症治疗中备受期待。尽管强效的化疗药物被用于治疗癌症，但由于其毒性，治疗窗口仍然很小，这会导致严重的副作用。因此，靶向疗法/药物递送需要区分健康细胞和癌细胞，而这两者本质上难以区分，以确保有毒分子能特异性地递送至病变组织。靶向治疗/药物递送的概念如图1所示，并将在本文中详细阐述。一般来说，这种方法的出发点是一种前药，它由三个部分组成，即靶向单元、连接体和毒性药物，从而形成一个单一的高度特异性和细胞毒性成分，在递送过程中处于非活性状态，但到达目标后则具有很强的效力。

图 1. 通过可裂解连接子连接的肽-药物偶联物靶向肿瘤的示意图。

靶向单元作为选择性载体，确保了毒素载体被癌细胞特异性摄取和传递。连接结构在载体和药物之间定义了一个确切的断裂点，从而能够控制活性毒剂在细胞内的释放。因此，这一概念促成了基于纳米粒子的递送平台、抗体药物偶联物，以及最近的肽药物偶联物的出现。

在本综述中，我们重点关注通过可裂解连接结构与药物偶联的肽类分子用于肿瘤靶向治疗。首先，描述了用作选择性载体以靶向肿瘤细胞的肽类分子所应具备的必要特性。在第二部分，将讨论不同的可用连接结构以触发细胞内释放，实现靶向递送。介绍了通过不同连接键引入毒药基团的合成方面，并概述了近期的研究进展。

肿瘤靶向肽作为选择性载体

已有研究表明，许多肿瘤细胞在其表面过度表达肽受体，与它们所源自的健康组织相比，情况更是如此。这使得与这些受体结合的肽有望成为选择性靶向肿瘤细胞的载体。由于这些肽通常具有纳摩尔级的高亲和力，因此在体内所需用量很小。结合并激活后，配体和受体可能会被内化，如果使用了可裂解的连接子，毒物载体就会被释放（图 1）。目前研究中较为知名的载体肽包括生长抑素（SST）、蛙皮素、血管活性肠肽、神经降压素（NT）、神经肽 Y（NPY）、α-黑素细胞刺激素、精氨酰甘氨酰天冬氨酸（RGD）和促性腺激素释放激素（GnRH）。基于氨基酸序列 RGD 的肽会与整合素受体结合，而整合素受体在肿瘤诱导的血管生成和转移中发挥着重要作用。所有其他激素肽则与属于G蛋白偶联受体（GPCRs）家族的受体结合。由于 GPCRs 是药物开发的主要靶点之一，因此对其生物化学特性已有深入的了解。除了这种新颖的靶向概念，目前已有多种经典的肽类药物。由于肽受体数量众多，它们可直接作用于癌症。这其中包括戈舍瑞林（诺雷得®，阿斯利康制药公司，英国伦敦），这是一种促性腺激素释放激素受体激动剂，因其能够抑制睾酮和雌激素的表达，被用于治疗乳腺癌和前列腺癌。奥曲肽（善宁®，诺华制药公司，瑞士巴塞尔） 是一种生长抑素受体（SSTR）激动剂，还被用于治疗生长激素分泌肿瘤。此外，放射性标记的肽类似物用于肿瘤成像和肽受体放射性核素治疗，是肿瘤诊断和治疗的有前景的工具，近期已有相关综述。除了源自天然激素的肽载体外，组合方法也被用于以非理性方式识别与肿瘤细胞相互作用的肽。这些所谓的肿瘤归巢肽也被用于基于纳米粒子的药物递送系统，以实现选择性递送。

在肽-药物偶联物中使用肽有明确的要求。肽必须以高亲和力和选择性与在癌细胞表面过度表达的受体结合，而这种特定受体在健康组织中的表达量应很低。因为对于大多数此类受体而言，存在不同的亚型，它们在人体不同组织中的配体特异性和表达水平各不相同，所以选择仅与在肿瘤组织中高密度均匀表达的受体亚型结合的肽类似物非常重要。例如，人 Y1 受体 (hY1R) 在乳腺癌中的表达情况。研究发现，hY1R 亚型在超过 90% 的乳腺肿瘤和 100% 的乳腺癌转移灶中过度表达。相比之下，健康乳腺组织中一般存在的是 hY2R 亚型。这种受体表达的转变为使用 hY1R-preferring 肽进行选择性肿瘤靶向提供了独特的机会。人 Y 受体（hYR）亚型 hY1R 和 hY2R 的天然配体是36个氨基酸的肽 NPY，它与这两种受体的结合亲和力均为纳摩尔级。由于对肽-受体相互作用的构效关系有了详细的了解，从而得以开发出 hY1R-preferring 肽 [F7,P34]-NPY 。在该肽中确定了不会改变其受体选择性的可能修饰位点，从而能够用各种分子对其进行衍生化，用于乳腺癌成像或治疗。这一概念通过在肿瘤患者中成功成像乳腺癌细胞的 N 端 99mTc-labeled [F7,P34]-NPY 类似物得到了令人印象深刻的证明。此外，还在 [F7,P34]-NPY 的三个不同位置用碳硼烷簇进行了修饰，作为硼中子俘获治疗（BNCT）的潜在应用。该肽保留了其选择性受体激活和内化特性，因此是含硼基团的良好载体。这些研究很好地表明，除了肽与受体的强亲和力外，生成亚型特异性肽对于选择性肿瘤靶向至关重要。该肽最好包含多个修饰位点以进行进一步的衍生化，这是肽相对于小分子的一个主要优势。所连接的分子不应影响载体肽的结合特性和选择性特征。因为通常肽中的并非所有氨基酸都是受体结合所必需的，所以可以用含有包括赖氨酸、半胱氨酸、谷氨酸或丝氨酸在内的可修饰侧链进行修饰是可行的。这为肽载体与所选连接子和毒性基团的衍生化提供了更多的化学选择。肽可通过固相肽合成法轻松获得，这是生产多达 50 个氨基酸肽的首选方法，且非常高效。此外，还可以在肽序列的特定位置引入非常复杂的修饰。这使得能够通过合适的偶联化学方法在期望的位置选择性插入连接子结构和毒性基团。最近，Zhang 等人通过固相和溶液相合成相结合的方法，利用可酶切的 GFLG 连接子在细胞穿透肽 TAT 的 C 末端或 N 末端与抗癌药物阿霉素（DOX）进行修饰。根据修饰位点的不同，两种肽表现出不同的细胞摄取情况，因而具有不同的细胞毒性活性，这突显了对载体分子进行明确修饰以连接毒性基团的重要性。

使用肽-药物偶联物进行肿瘤靶向的另一个重要方面在于，载体肽在与受体结合后需要触发内吞作用，以便将毒性药物递送至细胞内部，因为大多数小分子药物的肿瘤靶点都位于细胞内部。结合后，受体和肽必须通过受体介导的内吞作用进行内吞。在使用某种系统之前，必须对内吞作用进行表征，因为某些 G 蛋白偶联受体（例如 hY5R）无法内吞。通常，受体会被回收并重新定位到细胞表面，而带有连接药物的配体则大多会进入溶酶体。在此，根据连接类型的不同，毒物载体可通过多种机制释放。体外可通过荧光标记的受体或肽来可视化内吞过程，这在 NPY-hY 受体系统中已得到广泛研究。已通过稳定或瞬时表达与增强型黄色荧光蛋白或增强型绿色荧光蛋白融合的 hYR 亚型的细胞，证实了前面已描述的 hY1R-preferring [F7,P34]-NPY 和 hY2R-preferring [Ahx(5–24) ]-NPY 的 hYR 亚型特异性内吞作用。在对这两种肽进行碳硼烷簇修饰后，其内化特性得以保留，这为硼中子俘获治疗（BNCT）的潜在应用提供了可能。这表明，不仅载体肽本身，而且肽-药物偶联物的内化特性都很重要，需要在修饰后进行验证。此外，肽配体可以用荧光染料（如羧基四甲基罗丹明）进行标记，从而同时可视化肽和荧光标记受体的定位。这一点在监测 hY4R 亚型及其天然配体胰多肽（PP）的荧光标记类似物的内化过程时得到了令人印象深刻的证明，这些类似物正在作为抗肥胖药物进行研究。虽然用棕榈酸修饰的 PP 类似物内化迅速，但聚乙二醇（PEG）修饰的类似物则没有内化，尽管受体激活得以保留。这表明肽的修饰会显著影响其特性，并可能引发不同的潜在应用。

总体而言，肽类药物是安全的，因为它们不会与其他药物发生相互作用，在代谢过程中也不会产生有毒物质。另一方面，由于肽类药物会在肾脏和肝脏等器官中积累，且半衰期较短（会被蛋白水解酶降解），所以其生物利用度较低，并且会迅速经肾脏排泄。但在治疗糖尿病所用的胰高血糖素样肽受体（GLP-1R）激动剂领域，通过引入各种修饰来延长其半衰期的可能性已尤为明显。自 2005 年首个 GLP-1R 激动剂艾塞那肽（百泌达®，百时美施贵宝公司，纽约州纽约市，美国）获批，其半衰期约为 2.4 小时以来，已开发出半衰期为 4 至 7 天的新修饰肽，并已获批或处于临床试验阶段。这些方法也可用于稳定肽药物偶联物中的肽载体。

用于控制释放的连接技术

连接结构应当能够实现特定的细胞内毒性分子释放。因此，这些部分在循环过程中应当保持稳定，以防止毒性物质过早释放，从而导致非特异性细胞杀伤以及随之而来的不良反应。同时，在递送后，生物系统中温和且自然的变化应当能够触发细胞内裂解，从而释放出活性毒性物质，有效靶向癌细胞。此外，这些连接体需要在递送系统的合成过程中引入，这就要求在合成和纯化过程中的稳定性。连接体的选择对于合成策略的规划至关重要，因为载体和有毒分子中都需要存在必要的官能团。已经确定了不同的连接体结构，它们在递送过程中容易受到轻微环境变化的影响，因此适用于药物递送系统。最重要的策略总结在表 1 中，并在以下小节中进行讨论。

表 1. 靶向递送系统可用连接技术的选择

pH 响应型连接体

肿瘤组织的环境 pH 值比正常组织略低。癌细胞将葡萄糖转化为乳酸的速率较高，这会使 pH 值降低约 0.5 - 1.0个单位。如果给药系统在肿瘤环境中停留时间较长，这种微小的 pH 值变化可能会导致细胞外有毒分子的释放。细胞外系统与细胞内区室（如内体或溶酶体）的 pH 值存在较大差异，例如血液的 pH 值为 7.2 - 7.4，而内体或溶酶体的 pH 值为 4.5 - 6.0。由于肽配体通过受体介导的内吞作用被摄取，它们会在这些区室中积累。这种 pH 值的差异为利用这些变化来触发在这一狭窄 pH 范围内具有稳定/不稳定特性的化学键的断裂提供了独特的机会。

“前药”中最常用的酸不稳定性结构是腙类，与细胞内酸性环境相比，其在生理条件下具有更高的稳定性。 它们可以通过含羰基的有毒物质与含肼基的肽的选择性反应形成，反之亦然，这种反应在固相肽合成过程中很容易实现。这一概念已在 pH7.4 时保持稳定的腙键连接的肽两亲分子的合成及药物释放中得到证实。尽管腙键在抗体药物偶联物的开发中具有重要意义，但其在体内循环过程中不稳定，会导致严重的副作用，最终导致抗CD33 卡利奇霉素偶联物 Mylotarg® 的撤市。另一方面，研究表明，通过在腙键附近进行取代，可以调节药物偶联物中腙键连接的稳定性。为了在细胞摄取后通过聚合物载体的降解来释放有毒物质，已将几种酸不稳定的结构，如缩醛、顺式柠檬酸酯、亚胺、三苯甲基和β-硫代丙酸酯键，引入用于药物递送的聚合物主链中。尽管在固相肽合成过程中引入这些结构颇具挑战性，因为需要酸性条件才能将肽从固相载体上释放下来，但这些连接子有可能用于肽 - 药物偶联物。缩醛是很有前景的酸敏感结构，因为每降低一个 pH 值单位，键的断裂速度预计会加快 10 倍。此外，已有研究表明这些结构可以通过固相肽合成进行引入。最近，酸不稳定的顺式柠檬酸基团被用于将小分子药物阿霉素（DOX）连接到含有肿瘤靶向肽 RGD 的聚合物上。与酰胺连接的偶联物相比，顺式柠檬酸连接的化合物显示出更强的细胞毒性作用，而两种化合物都表现出细胞外稳定性以及相似的细胞摄取情况。

还原敏感键合

血清中硫醇的浓度远低于细胞内部位的浓度，这是由于细胞内存在高浓度的天然抗氧化剂，如谷胱甘肽。此外，细胞内区室（如内体或溶酶体）中存在氧化还原酶，有助于可还原化学基团的裂解。然而，Austin 等人表明，内体和溶酶体中的氧化还原电位是氧化性的，而非还原性的。不过，基于荧光共振能量转移（FRET）的研究，使用双荧光标记的细胞穿透肽或叶酸偶联物，通过可还原的二硫键连接，显示在细胞内部位二硫键被裂解，这通过荧光变化得以检测。这表明在细胞进入后，细胞内腔和区室中的还原机制确实处于活跃状态。因此，这些不断变化的条件为药物前体在靶细胞内递送后释放毒性物质提供了触发机制。

由于二硫键具有可还原性，因此在靶向药物递送中得到了广泛应用。例如，通过含半胱氨酸的肽与含巯基的有毒物质或前药反应，这些结构可以很容易地整合到肽-药物偶联物中，这使得它们成为理想的连接结构。通过在二硫键附近引入甲基，还可以进一步调节这些键在细胞外和细胞内的稳定性。

偶氮连接体能够通过微粒体偶氮还原酶经由 NADPH 依赖机制发生还原性断裂。对于偶氮连接的阿霉素纳米共轭物 ，已证实其断裂是由肝癌细胞中存在的酶所导致。通过在偶氮苯连接体的邻位和对位进行取代，可改变这些阿霉素 - 聚合物树枝状大分子共轭物的稳定性。这一方法可应用于使用肝癌靶向肽的肽-药物共轭物。

近来，硫酯这种众所周知的结构，由于其在天然化学连接中的应用，已被提议作为药物递送中的新型硫醇响应元件。它们具有与硫醇相似的稳定性特征，在细胞外条件下稳定，但在细胞内部位存在的谷胱甘肽浓度下可被裂解。此外，它们可以以无痕方式掺入生物分子，这一点已通过硫酯连接的蛋白质-聚乙二醇共轭物得到了证明。

酶可裂解连接子

不同的化学实体，如肽键、酯键和糖苷键，可被特定的酶水解。这些酶对其底物的特异性使得这些结构能够作为药物偶联物中的连接子加以利用。

肽键在循环系统中具有很高的稳定性，因为血液和血清中的蛋白水解酶活性极低，这归因于抑制剂的存在以及不利的高 pH 值。通过受体介导的内吞作用进入细胞后，溶酶体和内体中的蛋白酶，如组织蛋白酶，能够降解肽键。因此，肽连接子结合了酰胺键在体内的高稳定性以及通过特定酶切实现的快速细胞内释放。此外，这些蛋白酶在某些类型的癌症中会过度表达。已鉴定出大量易被这些蛋白酶切割的短肽序列。甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸（GFLG）氨基酸序列和较短的缬氨酸-瓜氨酸连接子在抗体药物偶联物中得到了广泛应用。这些连接子也可以通过固相肽合成轻松引入肽中。

β-葡萄糖醛酸苷键可被溶酶体中存在的酶β-葡萄糖醛酸苷酶特异性水解，该酶在某些肿瘤中会过度表达。β-葡萄糖醛酸苷酶响应型抗肿瘤前药的设计近来已有综述。. 此外，一种含葡糖醛酸的阿霉素前药已通过马来酰亚胺 - 半胱氨酸键与血浆蛋白白蛋白相连接。.白蛋白-阿霉素偶联物在体内显示出与游离阿霉素相似的抗肿瘤效果，同时避免了严重的副作用。像这样的前药也可用于肽 - 药物偶联物。

酯键和氨基甲酸酯键在被内化后可被酯酶和细胞色素 P450 水解，或者在溶酶体的酸性 pH 值条件下发生水解。这些结构可在肽合成过程中引入，但由于它们在血清中易发生水解，因此其细胞外稳定性需要严格控制。不同稳定性的氨基甲酸酯连接子已被用于将肿瘤靶向肽 SST 与细胞毒剂喜树碱（CPT）连接。这些化合物在血浆中表现出高稳定性，但对表达生长抑素受体（SSTR）的神经母细胞瘤细胞的细胞毒性作用较低，这归因于连接子的高稳定性。

自裂解连接子

药物直接连接到酶促或化学裂解位点可能会导致缓慢释放，这是由于空间位阻阻碍了对裂解位点的识别。因此，开发了自消解或自裂解间隔基，它增大了原刺激响应裂解位点与药物之间的距离。这使得前药能够以残留间隔基结构有效释放。为避免药物细胞毒性活性发生改变，该结构必须在连接体裂解后迅速且自发地去除，以无痕方式释放游离药物。

此外，载体和药物中存在的化学官能团限制了可用于连接它们的可引入的连接结构的数量。因此，为了使用所选的可裂解连接体，通常需要引入新的官能团。连接体应具有无痕性，以防止有毒剂的毒性特性发生变化。

自裂解连接子可根据引发连接子自分解的反应机制进行分类，包括基于消除反应和基于环化反应的体系，这些已在文献中进行了详尽的综述。在含有酶切位点（如短肽或β-葡萄糖醛酸酶响应键）的连接子中，基于 1,6 消除反应的结构受到了广泛关注，以提高酶切速率。在这种情况下，含羟基或氨基的药物分别通过碳酸酯或氨基甲酸酯基团与苯胺或苯酚在苄位相连。酶促或化学触发因素会引发电子级联反应，从而释放出游离药物。对氨基苯甲醇（PABC）基团被用于通过可被组织蛋白酶 B 切割的 Phe-Lys 连接子连接不同的小分子药物（方案 1a）。所有化合物在血清中均表现出高稳定性，而在组织蛋白酶 B 存在的情况下则观察到快速切割。不含 PABC 间隔基的前药由于酶切位点的位阻效应，仅表现出缓慢的释放曲线。

方案 1. 基于 1,6 消除（a）和硫醇辅助环化（b）的自裂解连接体裂解机制的示意图。

通过环化作用实现的释放机制是基于消除反应的自燃性连接体的一个重要替代方案。这些结构通过快速的分子内环化来释放游离药物。刺激响应性裂解会释放出一个亲核试剂，该试剂会分子内攻击羰基或缺电子的碳原子，从而将游离药物作为离去基团释放出来。Jain 等人利用这一概念，通过可还原的二硫键连接体，制备了含有不同自消除间隔基的相互前药，间隔基的选择取决于毒性药物中存在的官能团。这些结构在二硫键桥的β位含有酯、碳酸酯或氨基甲酸酯官能团，二硫键在硫醇辅助下发生还原时，会引发分子内环化反应从而释放药物。例如，通过在二硫键连接体的β位用酯键连接含羧基的药物（方案 1b）。二硫键的裂解会释放出一个硫醇基团，随后发生分子内反应，释放出硫杂环丙烷和游离的含羧基药物。这些连接系统也可引入肽 - 药物偶联物中，从而极大地丰富可用于无痕药物释放的结构种类。

毒剂与偶联化学

肽类药物偶联物的第三部分是负责整个智能递送系统细胞毒活性的毒性药物成分。该分子在共轭状态下应无活性，但在细胞内递送并释放后应具有很强的活性，并且作用机制明确。此外，它还应具有能通过可切割连接子与载体肽连接的功能基团。如果连接位点是对其生物活性至关重要的化学基团，则需要以无痕方式将其释放。由于毒效团中的化学选择有限，这并非总是容易实现。如果对毒性至关重要的功能基团进行了修饰，则必须保证毒效团能快速且无痕地释放。利用化学交联剂以及借助固相肽合成选择性引入官能团，为将毒效团引入肽中提供了多种可能性。

在肽-药物偶联物中使用的毒性药物通常是已确立的经典化疗药物，如阿霉素（DOX）、柔红霉素（DAU）、甲氨蝶呤（MTX）、喜树碱（CPT）、紫杉醇（PCT）以及金属基复合物。这些药物被癌细胞和健康细胞非特异性摄取，导致了与化疗相关的严重副作用。毒性分子中存在的可修饰官能团决定了其连接的可能性。图 2 中以 DOX 和 MTX 为例展示了部分选择。DOX 主要通过 DNA 插入、抑制拓扑异构酶 II 以及产生自由基来发挥其生物活性。它含有三个不同的官能团可用于潜在的偶联，为化学修饰提供了多种可能性。位于 C13 位的酮基可通过含肼交联剂生成腙键连接器。这已在 DOX 与对马来酰亚胺苯乙酸肼的衍生化反应中得到证实，从而得到腙键连接的 DOX 中间体（图 2a，红色）。将对硫醇敏感的马来酰亚胺基团与引入载体肽 NPY 中的半胱氨酸残基偶联，从而得到相应的腙键连接的共轭物。

肽-药物偶联物

除了各个部分所起的作用外，肽-药物偶联物作为完整的递送系统还包含更多方面。图 2 总结了肽-药物偶联物所有三个部分的最重要特征。根据用于肿瘤的肽家族对代表性偶联物进行分类。

图 2. 肽-药物偶联物各部分所需的关键特性。

结论

肽-药物偶联物为药物选择性递送至肿瘤组织提供了一种新颖的方法。肽具有许多有利特性，如高靶点亲和力、快速内化和低免疫原性，这使它们成为非常有前景的肿瘤靶向剂。在这一复杂的递送系统中，一个非常重要且常被低估的因素是选择合适的连接结构，以有效地释放毒性药物。有多种不同的化学基团可用，它们具有不同的释放机制。尤其是酯键因其易于引入和快速释放特性而被广泛使用。然而，酯键在循环中往往稳定性较低，因此需要详细监测其稳定性。对于含羟基的药物，氨基甲酸酯连接子可能是替代选择，因为它在血清中的稳定性更高。腙键常用于含羰基的药物，尽管在抗体-药物偶联物中，这些结构在体内不稳定。肟键已被证明是一种稳定的替代品，可与酶切位点或二硫键结合，从而有可能增强药物释放。二硫键在肽-药物偶联物中使用得相当少，这可能是由于大多数有毒药物中缺乏硫醇基团。这一问题可以通过使用新型无痕连接结构和化学交联剂来解决，这些交联剂可以通过固相肽合成选择性地整合到肽中。基于酶切位点的连接结构由于在循环中的稳定性和在细胞内的快速蛋白水解切割而经常被使用。为了将肽-药物偶联物的最佳连接体的选择从随机挑选转变为理性选择，对不同连接体结构进行更多的比较研究以评估其体外和体内特性是至关重要的。在抗体-药物偶联物的临床开发过程中所获得的详细知识以推动并加快肽-药物偶联物的发展。