摘要:
碳链订书桥特别是烯基订书桥是合成订书肽的经典方法, 1994 年由 Grubbs 小组报道了利用其发现的烯烃关环复分解反应 (RCM 反应) 进行多肽的结构改造[13], 该方法主要在合成多肽后通过对肽链 i 和i+4 位的丝氨酸进行侧链烯丙基醚化衍生再通过RCM 反应得到由环烯基桥稳定的a-螺旋肽 (图 1A)。Verdine 及其团队在此之后发展出利用具有末端烯烃侧链的非天然氨基酸替换天然多肽中的氨基酸残基并通过 RCM 反应形成环烯桥 (图 1B)。该方法解决了 Grubbs 方法中由于在合成多肽后再进行烯丙基取代所带来的对于多肽侧链结构的限制要求以及液相环合合成的不便, 并首次提出了“订书肽改造(peptide stapling)”的概念[11], 并经过不断的发展和改进成为了一种经典的普适性多肽改造策略和方法。
合成订书肽的关键砌块一般是具有α-烯烃侧链的非天然氨基酸 (图2A), 目前的研究主要采用 α-C 的绝对构型为 S 或 R 的手性烯基非天然氨基酸, 简称为 Sn 或 Rn (n 为侧链烯基中碳的个数)。此外, 还有用于缝合肽改造的 α-双烯基取代氨基酸, 如 B5[4]。通过高效、低耗、简便的有机合成方法制备上述的关键砌块是订书肽合成的必要条件。国内外许多课题组以不同策略建立了不对称合成手性氨基酸方法, 目前效果较好的方法包括: 以噁嗪酮 (oxazinone) 为手性配体, 通过不对称烷基化反应合成目标化合物[17−19]; 通过手性配体 BPB (benzylprolylaminobenzophenone) 与金属镍、丙氨酸 (甘氨酸) 反应生成复合底物, 经过手性诱导合成高对映选择性的手性氨基酸[20−22]。由于 B5 是非手性氨基酸,合成相对较为简便, 可采用 N-二苯亚甲基甘氨酸酯为起始物, 再进行甘氨酸酯 α-位两次烷基化反应, 最后经过酸解、去保护便可得到相应的 α-双取代氨基酸(图 2B)。通过上述方法合成得到的游离状态 Sn、Rn 和B5 与 Fmoc-OSu 或 Fmoc-Cl 反应生成相应的 Fmoc 保护的氨基酸后即可参与常规的 Fmoc 策略多肽合成。
根据 α-螺旋结构的特点, 完整的螺旋一周有 3.6个氨基酸残基, 在此结构中, i, i+4, i+7 和 i+11 位点的侧链处于螺旋的同侧 (图 3A)。订书肽改造策略利用这一特点, 通过位于同侧的 α-C 侧链进行 RCM 反应形成环烯桥。目前, 经典的改造方法是在 i, i+4 位点分别以两个 S 构型戊烯基丙氨酸 (S5) 替换原有氨基酸残基并形成 staple, 从而实现固定 α-螺旋一周[11](图 3B); 如用相似的方法在 i, i+7 处形成 staple 则可以固定螺旋两周, 相应两位点处则需要侧链更长的R8 和 S5 或 S8 和 R5 的组合 (图 3C)。除了上述两种经典方法外, i, i+3 位点也可适用订书肽改造, 但需要注意的是 staple 的长度具有一定的灵活性: 当其为 8 个碳原子时, 需要 R5 与 S5 的结合 (图 3D); 当其为 6 个碳原子时, 则需要 R5与 S3或者 R3与 S5的组合才可以维持合适的多肽构象[32, 33]。
订书肽的合成与一般的多肽固相合成基本一致, 较为特别的是 Sn 或Rn 在引入时, 由于位阻较大需要如 PyAOP 等较为高效的缩合剂确保缩合反应的链接效率。由于该 α-双取代氨基酸的游离氨基无法通过常规的 Kaiser 茚三酮方法进行监测, 可在相应位置的氨基酸缩合完成后取少量进行裂解并采用 LC/MS 方法进行确证。为确保RCM 反应在单条多肽分子内发生, 环合反应需要利用固相合成的假稀释效应[36]在固相树脂上进行。整个订书肽的合成制备过程大致分为肽链的合成、侧链的 RCM 反应、N-端的修饰、载体的切除、订书肽的纯化等几个步骤 (图 4), 已经成为较为成熟的方法[37]。
除了上述研究较早并即将成药的订书肽类化合物以外, 随着订书肽成为多肽药物研究的热点, 研究发现了多种调节疾病相关 PPIs 的订书肽药物先导物。表 1 总结了目前已报道的与靶蛋白相互作用确切、具有显著药理活性的订书肽改构物的研究情况。
2 其他类订书肽的合成设计及应用
在上述采用 RCM 反应稳定 α-螺旋的订书肽策略问世之前, 通过侧链间的偶连稳定多肽 α-螺旋构象的工作已有很多报道, 例如在侧链间形成酰胺键[101]、偶氮苯[102]、腙[103]、二硫键[104]等, 但这些方法改造后的多肽却并不能称之为订书肽, 主要由于它们在药代学性质上不如全碳氢链订书肽稳定[105]。近年来也出现了一些新的改造策略, 虽然它们的链接环也有杂原子参与, 但其在稳定构象、提高活性和药代稳定性方面与经典全碳氢链订书肽有异曲同工之处, 可以将其归为广义的订书肽改造方法。下文将按照连接桥环的结构对其进行分类说明。
2.1 三唑桥环
点击化学 (click chemistry) 中的 Huisgen-1,3 偶极环加成[106]反应是在铜催化下, 炔基与叠氮基反应生成区域选择性的 1,4-取代三唑。由于 Click 反应具有高反应性、选择性和生物相容性[107−111], 其环加成产物具有对蛋白水解酶的稳定性[112]等优点, Cantel等[113]便率先尝试将该环加成反应应用到多肽侧链的偶联并取得了令人满意的结果。该方法在肽链的 i, i+4 位点处分别引入了 α-位末端具有炔基和叠氮基的非天然氨基酸, 最后纯化的肽链在液相中通过 CuSO4与抗坏血酸的催化发生 click反应形成“三唑桥”(图5)。利用 click 反应改造的 PTHrP 肽比其原形肽活性提高了 5~10 倍, 并与酰胺桥改造后的 PTHrP 肽有着相似的生物活性[114]。随后 Kawamoto 等[115]在设计合成 BCL-9 订书肽时也应用 click 反应来构建三唑桥, 通过嵌入位点的筛选以及三唑桥长度的变换优化出理想的订书肽。特别是在该肽链上引入的双三唑桥环使得改造后的订书肽 α-螺旋含量大于 90%, 最高甚至达到 99%, 其亲和力以及代谢稳定性与野生型 BCL9相比都有很大的提高。
相比全碳氢链订书肽, 三唑订书肽的形成所需要的铜催化剂非常廉价且毒性较低, 是一种可行性较高的订书肽构建方法, 但目前对于它在 α-螺旋性以及酶解稳定性上改善作用仍需深入研究。
2.2 硫代桥环
在多肽或者蛋白质的修饰改造中,半胱氨酸的衍生化已成为一种必不可少的构建方式,也是化学生物学研究的重要方法。虽然目前改造半胱氨酸的方法有烷基化、共轭加成、氧化和还原等方法[116,117],在肽链上通过侧链巯基之间偶连构建桥环来稳定 α-螺旋的方法大多局限于形成二硫键。然而当二硫键处于氧化或还原条件时其性质不够稳定。利用其活性巯基与其他代谢相对稳定的连接结构反应得到的桥环比二硫键的稳定性强, 由此也衍生出下述多种新型订书肽构建方法。
2.2.1 硫代甲基联苯桥环
Muppidi 等[118]报道了利用 4,4'-二溴甲基联苯 (Bph) 或 6,6'-二溴甲基-2,2'-联吡啶 (Bpy) 作为连接臂, 通过与 i, i+7 位的半胱氨酸侧链反应形成硫代甲基联苯或联吡啶桥环 (图 6)。他们随后将该改造策略运用到具有 p53-MDM2/MDMX 相互作用双重抑制作用的多肽序列 (LTFEHYWAQLTS) 改造中。由于这段序列中不含有半胱氨酸, 因此将暴露在溶剂侧的 Glu4 和 Thr11替换为半胱氨酸再进行桥环的构建。通过活性筛选显示改构后的订书肽不但 α-螺旋含量和生物活性有改善而且穿膜能力得到了大幅度的提高。
Muppidi 等[119]又运用硫代甲基联苯策略对 Sticht等[61]报道的抑制 HIV-1 病毒衣壳的组装的 CAI 蛋白片段 (ITFEDLLDYYGP) 进行改构, 将溶剂侧的 Glu4和 Gly11 替换为半胱氨酸后进行桥环的构建。对改构物活性测试显示, 其穿膜能力都有极大的提高, 且在细胞水平的病毒感染实验中显示出高抑制活性。尤 其是筛选出一条既能够与 HIV-1 衣壳蛋白碳端结合(KD =17.5 μmol·L−1) 又能与 gp120 蛋白结合 (KD =7.4 μmol·L−1) 的改构订书肽 (ISF[CELLDYYC]ESGS), 说明其具有抑制衣壳组装和抑制 HIV-1 病毒的进入细胞的双重抑制作用。
来自 BH3 蛋白中的多肽 NoxaB-(75−93)-C75A(AAQLLRIGDKVNLRQKLLN) 能够高选择性的与Mcl-1 蛋白结合从而产生抑制 MCL-1 的作用[120]。Muppidi 等[121]为了优化多肽 Noxa BH3 的活性, 通过硫代甲基联苯桥环策略, 将 Gln77与 Lys84替换为半胱氨酸 (AACLLRIGDCVNLRQKLLN) 再进行 staple 构建。随后对系列改构物进行生物活性测试, 结果显示经过改构后的订书肽的 α-螺旋含量、穿膜能力以及酶解稳定性都有大幅度提高, 而且对 MCL-1 过度表达的 U937 细胞有很好的抑制活性。
2.2.2 硫代氟苯桥环
Spokoyny等[122]以全氟苯或全氟联苯为连接结构,立体专一性地串联起i,i+4位的巯基侧链从而形成硫代氟苯桥环。应用此方法进行了HIV-1病毒衣壳CAI蛋白片段的改构设计,该方法得到的订书肽能有效抑制HIV-1病毒的形成,且在结合能力、穿膜能力以及酶解稳定性上都优于未经过改造的原形肽(图7)。该方法在一定程度上是对烯烃复分解法的补充,且在反应的过程中需引入金属催化剂, 同时也不需要非常昂贵的非天然烯基氨基酸, 因而合成成本也大为降低。
2.2.3 硫代四嗪桥环
Brown 等[123]在对半胱氨酸残基侧链改造时, 通过 3,6-二氯-1,2,4,5-四嗪与巯基发生取代反应后形成硫代四嗪环来稳定 α-螺旋构象。硫代四嗪桥环在光化学反应下可发生裂解形成硫氰酸酯侧链, 之后可在半胱氨酸的作用下复原成原肽(图 8)。
2.2.4 巯基−烯点击反应
Wang 等[124]报道了利用巯基−烯点击反应构建订书肽以及多肽的大环化。以不同长度的二烯与两个肽链巯基在 365 nm 光照下室温反应, 在 i, i+4 与 i, i+7 位点之间构建硫代桥环的同 时, 对其他官能团有极好的耐受性, 因此可以在氨基酸侧链未经保护的状态下进行反应 (图 9)。随后他 们比较了通过 RCM 反应形成的全碳氢链 Axin 订书肽[60]与应用巯基−烯点击反应改构订书肽的 α-螺旋性, 发现两者在圆二色谱中具有几乎一致的 α-螺旋比例。随后又发现全碳氢链的 p53 订书肽类似物与硫代桥环构建的订书肽在抑制 p53-MDMX 相互作用时表现出了相似的抑制活性, 并可选择性的诱导 p53 野生型细胞的凋亡。该方法能直接用于未保护的多肽, 同时也不需要金属催化剂的使用, 而且这种类似全碳链的链接臂的使用能够避免与大体积的芳香基团发生非特异的反应。
2.2.5 巯基−炔点击反应
Tian 等[125]报道了运用光引发的单组分巯基−炔点击反应, 高效简洁在侧链未经保护的 α-螺旋肽上构建硫−烯桥环。在肽链的 i, i+4位上分别引入戊炔甘氨酸 (M5) 与半胱氨酸, 随后在 365 nm 的光引发条件下完成桥环的构建。用该策略对调节雌激素受体−共同激活剂相互作用的 α-螺旋肽进行改构, 通过与全碳氢链改构后的订书肽的比较, 显示硫−烯桥环订书肽亲脂性变化较大而且细胞膜毒性较低。硫碳双键为进一步的功能化提供了可 能, 同时也丰富了订书肽的改构方法, 将古老的硫与炔自由基加成反应扩展到了化学生物学的研究中来(图 10)。
2.2.6 炔烃复分解反应
Cromm 等[126]报道了将烯烃复分解 (RCM) 与炔烃复分解 (RCAM) 反应以正交的方式联合应用于多肽的结构改造中, 其关键环节在于除了向目标肽中的四个环合位点 (i, i+3, i+4, i+7) 中的两处引入烯基氨基酸 (S5) 以外, 在另外两个位点处需引入侧链为炔基的非天然氨基酸。由于RCM 反应 (钌催化) 和 RCAM 反应 (钼催化) 条件的正交性, 与双订书肽[33]相比, 可以选择性的控制环合的的位置从而实现对环肽拓扑结构的控制。作者将该方法应用于 GTPase 酶抑制剂的环肽改造中并得到了活性改善的抑制剂 StRIP3 (图 11)。需要指出的是虽然作者选取的改构活性肽先导物并非 α-螺旋肽, 但该研究作为经典订书肽方法的延伸值得借鉴。
3 总结与展望
订书肽通过用侧链环合的方法提高了 α-螺旋肽的构象稳定性从而极大的提高与靶蛋白的亲和力、代谢稳定性、穿膜性。订书肽在药效、成本以及技术难度上填补了小分子药物与单克隆抗体在蛋白−蛋白相互作用为靶点的药物研究中各自的不足, 已成为获得以蛋白−蛋白相互作用为靶点的药物先导物的一种有效途径。通过对已有研究的分析可以发现, 目前订书肽的研究主要集中在两个方向, 其一是对分子生物学和结构生物学研究发现的可调控蛋白−蛋白相互作用的活性 α-螺旋肽采用经典的烯基全碳订书桥策略实施改造, 该研究方向起步最早且即将形成首个订书肽新药, 证明了订书肽药物开发的可行性; 另一个方向是在合成方法学方面采用已有或开发新的偶联反应来构建具有新结构的新型订书肽, 该方向也逐渐成为了有机化学与化学生物学的交叉研究热点。但由于活性螺旋肽的获得非常依赖于结构生物学的晶体结构或是分子生物学的发现, 对于单独从事合成方法学研究的课题组而言往往采用已有报道的活性订书肽作为先导物或是采用无生物学活性的模型螺旋肽作为研究对象。订书肽研究已经成为近年来多肽药物研究的热点, 正如订书肽研究领域的领导者Walensky 教授所述[127], 该方法对多肽性质的许多革命性改善将使得多肽药物的研究得到复兴。可以预见, 随着订书肽研究的不断深入, 在订书肽结构设计、合成方法以及新靶点的发现方面将不断有新的研究成果产生, 也必将为抗肿瘤、抗病毒、抗细菌感染、内分泌调控、诊断试剂等方面的药物研究提供新的思路和解决方案。
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