摘要：本文重点介绍了脑穿透肽和脑可渗透的 PDCs 作为递送载体，将小分子药物负载物穿过血脑屏障（BBB）递送至脑实质（图 1 和图 2）的最新发展。文中总结了脑内皮细胞上表达的肽及其特异性受体、药物负载物的选择和 PDCs 的连接子、脑转运机制以及向脑的递送效率。
BBB穿梭肽是通过噬菌体展示技术发现的，或者从天然神经营养蛋白或某些病毒中衍生而来，并利用受体介导的细胞内吞分子机制来跨越血脑屏障。脑血屏障（BBB）可渗透的肽偶联药物（PDCs）由 BBB 穿梭肽、连接子和药物分子组成，利用内源性转胞吞作用机制并诱使大脑允许这些生物活性分子穿过 BBB，已成为一种很有前景的中枢神经系统药物递送系统。在此，我们研究了脑渗透肽穿梭物和脑可渗透 PDCs 作为分子载体将小分子药物有效载荷递送穿过 BBB 到达脑实质的最新发展。重点介绍了脑内皮细胞上表达的肽及其特异性受体的贡献、药物有效载荷的选择、PDCs 的设计、脑进入机制以及向大脑的递送效率等新知识。
在中枢神经系统药物开发中，实现神经治疗药物穿过血脑屏障（BBB）仍然是一个巨大的挑战，尤其是对于蛋白质和核酸治疗药物而言。血脑屏障极大地限制和控制物质进入大脑的流动，并充当着大脑的守门员角色，从而增加了药物成功到达大脑的难度。据估计，只有2%的非活性外排转运蛋白底物、亲脂性小分子神经治疗药物（分子量< 500 Da，LogP接近2）能够穿过血脑屏障并到达中枢神经系统治疗靶点；超过98%的小分子和几乎100%的大分子药物，包括肽类、重组蛋白、单链抗体、基于RNA干扰（RNAi）的药物和基因疗法，都不符合穿透血脑屏障的要求。这极大地阻碍了这些化合物成为有效的中枢神经系统治疗药物的潜力。
为了克服向大脑输送药物的障碍，已经开发出了多种策略来向中枢神经系统输送神经治疗药物。中枢神经系统药物输送策略主要分为两类：侵入性和非侵入性药物输送。侵入性程序旨在物理穿透血脑屏障，例如通过手术植入脑室导管，然后将药物注入脑室腔，通过鞘内注射向腰段蛛网膜下腔给药，通过颈动脉灌注高渗溶液如甘露醇或颈动脉动脉灌注血管活性物质如缓激肽或缓激肽类似物来暂时打开血脑屏障，利用微泡聚焦超声暂时破坏血脑屏障，或者在脑部植入化学治疗聚合物薄片。这些程序对患者不友好，并且存在潜在的健康风险。非侵入性方法旨在在不破坏血脑屏障物理完整性的情况下穿透血脑屏障。这些方法包括利用血脑屏障中与生物学相关的内源性转运机制，如受体介导、吸附介导和载体介导的转运系统，近年来这些系统在营养物质、激素和转运蛋白方面得到了很好的研究；或者通过化学修饰药物，利用脂质化技术将药物与长链脂肪酸共价连接，以增加药物通过血脑屏障的通道，从而提高药物的脂质溶解性和血脑屏障的渗透性。
一种很有前景的非侵入性策略是识别血脑屏障穿透肽或血脑屏障穿梭蛋白作为脑部递送分子载体，以增加穿过血脑屏障的运输。分子策略旨在通过将治疗剂化学连接到血脑屏障靶向配体或血脑屏障穿梭蛋白上，从而劫持血脑屏障的内源性流入运输，该配体或穿梭蛋白与其受体结合，触发转胞吞作用并将药物运输到血脑屏障的腔面。血脑屏障运输肽和血脑屏障穿梭蛋白-药物构建体有可能欺骗大脑允许这些分子通过，从而促进药物进入脑实质。从中枢神经系统药物递送的角度来看，这种受体介导的运输是一种非常有吸引力的策略，因为理论上，各种分子质量或物理化学性质的分子货物，包括小分子和生物制剂，都可以通过这一过程进行运输。血脑屏障穿梭蛋白-药物构建体或脑渗透肽-药物偶联物（PDC）已成为一种很有前景的非侵入性药物递送方法之一。
在血脑屏障（BBB）的传递方面。与分子量超过 150 千道尔顿且血脑屏障穿透能力有限的抗体药物偶联物（ADC）相比，肽药物偶联物（PDCs）分子量更低，易于大规模低成本合成，并且允许对氨基酸进行修饰，以增强在循环中的稳定性和血脑屏障的渗透性。
2 | 血脑屏障是中枢神经系统药物递送的主要障碍
大脑是一个非常复杂的重要器官，包含各种类型的脑细胞，每种细胞都有不同的功能。神经元是电兴奋细胞，用于传递信息，内皮细胞形成脑血管，星形胶质细胞为神经元功能提供支持，小胶质细胞是大脑的常驻巨噬细胞，负责大脑的免疫监视。其他大脑巨噬细胞，如血管周围巨噬细胞，位于血管外表面，并在脑实质与循环之间的界面执行活动（图1和图2）。人类大脑拥有一个超过400英里长的血管网络，包括大脑动脉、小动脉和毛细血管。几乎每个神经元都有自己的大脑毛细血管供血。
中枢神经系统药物在大脑中的传递存在三个主要障碍。首先，血脑屏障（BBB）是血管与脑实质之间的一道生理屏障（图1）。其次，血脑脊液屏障（BCSFB）是血液循环与脑脊液循环之间的屏障。BCSFB由以下结构形成：
脉络丛紧密连接的上皮细胞面向血脑脊液。第三，无血管的蛛网膜屏障位于硬膜下，并完全封闭了中枢神经系统，在中枢神经系统药物向大脑的转运中发挥着重要作用。在这些屏障中，血脑屏障是最重要的屏障，对脑细胞的直接微环境控制最为严格。
2.1 | 血脑屏障的特性
血脑屏障受到严格调节，只允许必需的离子、营养物质和激素进入大脑，并阻止可能有害的血源性外源性物质进入大脑。血脑屏障是由内皮细胞组成的连续层，排列在大脑毛细血管内，周围包裹着基底膜、周细胞和星形胶质细胞的终足。脑微血管内皮细胞之间具有特殊的紧密连接，血管腔完全封闭（图 1）。星形胶质细胞、周细胞、内皮细胞、基底膜、小胶质细胞和神经元都在血脑屏障的完整性中发挥着关键作用（图 1）。
图1 血脑屏障（BBB）和其他神经血管单元组件的示意图。血脑屏障是由连续的脑内皮膜组成的细胞多屏障，通过紧密连接、周细胞和星形胶质细胞足末紧密封闭。血脑屏障将脑实质与外周血循环隔离开来，并作为中枢神经系统与外周之间的血管界面，调节两者之间的通信。脑穿透血脑屏障穿梭肽偶联药物可以通过利用内源性运输分子机制，穿过血脑屏障，到达脑实质。
与外周的内皮细胞不同，脑内皮细胞缺乏窗孔（允许血液和组织之间快速交换分子的孔隙），从而限制了分子的流动。紧密连接的的存在限制了相邻内皮细胞之间分子的流入（细胞旁途径；图2）。结构上，相邻脑内皮细胞之间的紧密连接形成了一个连续的网络，由平行的、相互连接的跨膜和细胞质蛋白链组成，以封闭细胞旁间隙，从而作为细胞旁门限制亲水性分子的细胞旁流动。这些特性使得脑微血管能够形成一层紧密的细胞层，其跨内皮电阻（TEER）超过1000 Ωcm 2。血脑屏障（BBB）显示内皮细胞对液滴的吞噬作用（即活细胞摄取液滴的过程）大约减少了 100 倍。
图 2 血脑屏障（BBB）分子运输的主要路线的示意图。分子穿过血脑屏障的主要途径包括被动扩散（细胞旁和跨细胞途径）、载体介导的细胞内吞（CMT）、受体介导的细胞内吞（RMT）、吸附介导的细胞内吞（AMT）和细胞介导的细胞内吞。血脑屏障上表达了药物外排转运蛋白，以限制许多分子进入大脑。脑穿透血脑屏障穿梭肽和肽-药物偶联物（PDCs）可以利用血脑屏障上过度表达的受体或转运蛋白，通过受体介导的细胞内吞介导药物穿过血脑屏障。
血脑屏障并非是静态的，而是高度动态的。内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞和与血脑屏障密切接触的神经元（神经血管单位或NVU）之间的各种细胞内和细胞间信号事件控制着分子的通透性（图1）。内皮细胞腔侧（血液侧）和膜外（大脑侧）膜上的特殊蛋白质调节葡萄糖等代谢产物的通过，并控制分子的进出（图2）。血脑屏障严格控制外周免疫细胞进入大脑。微胶质细胞（中枢神经系统驻留的巨噬细胞衍生细胞）的存在有助于调节中枢神经系统实质中的免疫反应。免疫细胞如T淋巴细胞在中枢神经系统损伤和疾病期间可以进入大脑。一项新的发现表明，某些血浆蛋白向大脑的运输随年龄而变化，从健康年轻小鼠的配体特异性、受体介导的转胞吞作用转变为老年小鼠的非特异性小窝摄取。所有这些特征使得血脑屏障充当了物理屏障（紧密连接）、“运输屏障”（特定的运输系统）、“代谢屏障”（专门的酶系统）以及“免疫屏障”。
2.2 | 分子穿过血脑屏障运输的途径
由于血脑屏障（BBB）的“紧密性”，分子的旁路细胞运输最小化；药物和必需分子主要通过被动扩散、载体介导的运输、受体介导的转胞吞咽、吸附介导的转胞吞咽或通过细胞介导的转胞吞咽的作用进入大脑（图2）。转胞吞咽是一个过程，通过膜包囊将分子从细胞的一侧转移到细胞的内部，然后转移到细胞的另一侧。相对于外周内皮细胞，脑内皮细胞表现出相对较低的囊泡运输速率。
2.2.1 | 被动扩散
被动扩散是指化合物在浓度梯度的方向上移动，无需能量，且不可饱和。简单扩散是大多数亲脂性小分子中枢神经系统药物的主要进入机制。最大细胞-毛细血管距离为20微米，小分子可以在半秒内渗透。物质进入大脑的扩散可以分为细胞旁扩散和细胞内扩散（图2）。细胞旁扩散受到脑内皮细胞之间紧密连接的限制。细胞内扩散主要取决于分子的渗透性。小亲脂性物质如酒精和类固醇激素可以通过非饱和扩散进行细胞内渗透。高度脂溶性药物地塞米松可以轻易地穿过血脑屏障，产生镇静作用。一般来说，小分子量（<500 道尔顿）、弱氢键（少于 6 个氢键）、亲脂性（LogP > 2）以及不存在自由旋转键和极性表面积（PSA）< 60 至 70 平方埃，都有利于通过扩散穿过血脑屏障。在测量通过被动扩散的药物渗透性时，所有这些参数都是综合考虑的，而不是单独考虑。对于天然肽，除非肽具有两亲性结构或通过合成方法使其具有亲脂性，否则被动扩散非常有限。
2.2.2 | 载体介导的细胞内吞作用
必需营养素如葡萄糖、氨基酸和核苷酸通过高度选择性和立体特异性转运蛋白，通过载体介导的跨细胞运输（CMT）机制穿过血脑屏障。转运蛋白在腔侧识别底物，然后底物-转运蛋白结合系统触发载体蛋白从外向到内向状态的构象变化，导致底物通过浓度梯度向膜的腔外侧运输（图2）。如果化合物需要逆浓度梯度移动，ATP可能提供能量来促进这一过程。大脑内皮细胞膜中有几个运输系统用于营养物质和内源性化合物的运输，例如GLUT1葡萄糖转运蛋白用于葡萄糖和某些己糖的转运，酸性氨基酸转运系统用于谷氨酸和天冬氨酸的转运，以及LAT1大中性氨基酸转运蛋白用于苯丙氨酸和其他中性氨基酸的转运。LAT1还转运一些药物，如L-多巴胺、加巴喷丁或美法仑，这些药物与内源性底物具有相似的分子结构和大小。
2.2.3 | 受体介导的转胞吞作用
脑毛细血管内皮细胞具有受体介导的转胞吞作用（RMT）机制，作为特定和选择性摄取某些大分子的手段。一般来说，循环中位于脑内皮细胞腔侧的配体与其特异性受体结合，受体-配体复合物通过囊泡运输机制穿过细胞内室，通常通过内体/溶酶体系统。然后，受体-配体复合物解离，配体从复合物中释放到内皮细胞非腔侧的细胞外空间，受体被回收至内皮细胞的腔侧（图2）。血液中的某些大分子通过已充分表征的内源性受体（如胰岛素、转铁蛋白和瘦素）穿过血脑屏障。关于不同的中枢神经系统疾病如何影响受体的表达及其调节，目前了解有限。受体介导的转胞吞作用有可能被利用作为向大脑递送治疗性分子的策略。
2.2.4 | 吸附介导的细胞内吞作用
吸附介导的转胞吞咽（AMT）是一种非特异性的转胞吞咽，它是由某些大分子的带正电荷部分与含有阴离子乙酰肝素蛋白聚糖的脑内皮细胞膜之间的静电相互作用所触发的。AMT的过程包括静电复合物的内陷，随后形成内涵体，从腔侧运输到非腔侧，并释放AMT底物。在AMT促进的中枢神经系统药物递送策略中，通常使用多阳离子蛋白，如鱼精蛋白或含有阳离子序列的细胞穿透肽，如SynB肽（图2）。有趣的是，导致COVID-19爆发的SARS-CoV-2病毒的1型蛋白可以通过一种类似于AMT的机制穿过小鼠血脑屏障。与阳离子蛋白或肽相关的潜在缺点是它们的随机分布，因此缺乏对大脑的选择性，以及与内皮损伤相关的潜在毒性。
2.2.5 | 细胞介导的转胞吞作用
细胞介导的转胞吞咽是最近发现的一种药物穿过血脑屏障（BBB）的运输途径。单核细胞被认为是一种“特洛伊木马”，被病原体用作进入中枢神经系统的交通工具。一些病原体，如人类免疫缺陷病毒（HIV），通过这种运输途径进入大脑（图2），其中感染HIV的单核细胞和/或巨噬细胞在正常迁移过程中穿过血脑屏障进行免疫监视，或者由于产生促炎介质改变血管通透性。许多神经系统疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、脑瘤和艾滋病相关痴呆，都有炎症成分。在炎症过程中，广泛招募白细胞（单核细胞和中性粒细胞）。这些细胞通过被称为细胞外渗和趋化作用的过程向炎症部位迁移，这是独特的。细胞介导的转胞吞咽已被开发成一种令人兴奋的策略，用于实现血脑屏障的治疗性药物递送。基于免疫细胞、神经干细胞和间充质干细胞的脑瘤治疗药物载体已被探索。
2.2.6 | 活性外排转运
血脑屏障的毛细血管内皮细胞上表达着药物外排转运蛋白，这限制了许多药物进入大脑的能力。这些外排转运蛋白能够将药物泵出细胞，从而通过将它们排除在大脑内皮细胞之外，对进入血脑屏障形成了额外的限制（图2）。大多数这些外排转运蛋白属于ATP结合盒超家族蛋白，包括P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白（MRP）和乳腺癌耐药蛋白。总之，血脑屏障严格调节着必需物质和信息分子（如肽）的流入和流出，并作为中枢神经系统与血液之间的通信接口。
3 | 血脑屏障穿梭肽的发现
3.1 | 用于脑部递送的 BBB 穿梭肽
不断增长的研究兴趣要求发现能够将神经治疗货物（如蛋白质、基因和药物）运输到脑实质的脑归巢和脑穿透分子载体。其中，血脑屏障（BBB）穿透肽或血脑屏障穿梭肽因其易于合成和修饰、免疫原性较低以及与经典的血脑屏障穿梭蛋白（如特洛伊马抗体）相比成本较低而受到关注。近年来，含有多达50个氨基酸残基的线性或环肽已被发现作为血脑屏障穿梭肽，并被用作载体或靶向元素将药物递送至大脑。这些肽具有一些共同特征，包括（a）对特定受体的强亲和力，这些受体通常在大脑血管的腔侧表达，以触发内化；（b）介导细胞吞咽的能力；以及（c）能够以非侵入性的方式促进货物运输到脑实质，而不影响血脑屏障的完整性（图2）。一些血脑屏障穿梭肽穿透血脑屏障，而不需要受体。这种肽主要属于细胞穿透肽（CPP）家族，由短的两亲性和/或阳离子序列组成，通过非离子体机制（AMT 机制）具有高度穿透细胞膜的能力。血脑屏障穿梭肽主要源自嗜神经的内源性蛋白质、神经毒素、某些病毒以及内源性肽，或者通过噬菌体展示生物筛选和修饰而发现。
噬菌体展示技术（PDT）由G.P.史密斯（1985年）引入，为发现生物活性肽和抗体打开了一扇门。它是生产大量不同肽和蛋白质（多达10-10)）以及体外和体内鉴定与生物靶标结合的配体的有价值工具。噬菌体展示技术的基本原理是蛋白质表型（展示的肽，通常特异性地与感兴趣的靶标结合）与其相应的基因型（编码该蛋白质的DNA；帕施克，2006年）之间的物理联系。噬菌体是一种纤维状的病毒，感染细菌宿主。噬菌体展示是指通过将编码外源性蛋白质的基因插入噬菌体基因组的衣壳蛋白基因中，使蛋白质或肽类结合物在噬菌体表面表达的过程。通过亲和选择噬菌体展示的随机库在固定化靶标或体内组织上，也称为生物筛选，来鉴定蛋白质或肽类结合物（图3(a)）。泛素化过程的主要步骤包括：(a) 噬菌体库与固定化靶标（体外生物泛素化）或噬菌体注入动物（体内生物泛素化）的孵育；(b) 清洗以去除非结合噬菌体；(c) 使用酸或高盐洗脱结合物；(d) 通过感染宿主大肠杆菌细胞来扩增洗脱的噬菌体颗粒（图3(a)）。生物泛素化可以在血清样本、分离的受体、细胞表面受体或特定器官（体内）上进行，通常进行三到五轮以获得对靶标具有最高亲和力的肽或蛋白质。生物泛素化后，通过噬菌体DNA的测序来鉴定肽序列（图3）。接下来，通过与乱序肽进行功能分析来确认分离肽的特异性。其他方法，如对归巢噬菌体的免疫染色或者对噬菌体或合成肽进行荧光或放射性标记，以确定其在器官组织中的选择性分布。
图 3 源自噬菌体展示生物筛选技术和神经嗜性蛋白的血脑屏障穿梭肽的示意图。（a）针对体外靶点或体内组织的噬菌体展示生物筛选过程。噬菌体文库与体外固定在表面或体内注射到动物体内的靶点结合。经过孵育，未结合的噬菌体被洗掉，结合的噬菌体通过洗脱收集并进一步扩增。进行多轮选择以富集亲和力强的噬菌体。高亲和力的噬菌体结合物通过 DNA 测序进行纯化和测序，以确定靶点结合肽的序列。这些靶向肽进一步合成，并在体外血脑屏障 Transwell 检测中进行评估，以鉴定血脑屏障穿梭肽。（b）鉴定负责神经嗜性蛋白穿过血脑屏障的片段。（c）噬菌体展示技术鉴定出针对小鼠大脑中低密度脂蛋白受体（LDLR）的血脑屏障穿梭肽 LRPep2。展示了 LRPep2 的结构以及肽 - 蛋白质结合的计算对接（顶图），以及罗丹明标记的 LRPep2-rho（红色）与 LDLR（绿色）在小鼠脑切片上的共定位（底图）。
利用这种噬菌体展示技术，万等人将 C7C 噬菌体展示库通过鼻腔给大鼠使用，从脑组织中回收噬菌体，并鉴定出一种克隆7的肽序列（ACTTPHAWLCG），它能够通过嗅觉区域从鼻腔到大脑的通路绕过血脑屏障。使用噬菌体展示技术发现的7个残基的肽 pepC7（CTSTSAPYC；表 1）显示出向脑组织的特性，其转位效率比随机库噬菌体高 41 倍。布尔泰等人利用噬菌体展示技术鉴定出一种很有前景的血脑屏障穿过的肽序列 LRPep2（HPWCCGLRLDLR；表 1），它针对低密度脂蛋白受体（LDLR）的细胞外结构域，这在小鼠脑切片上血管中 LRPep2 与 LDLR 共定位的免疫荧光染色中得到了证明（图 3(c)）。通过噬菌体展示技术发现的血脑屏障穿梭肽的其他例子，如 L57、VH4127、肽 22、THR、CRT、HAI、SLS、12-mer-1.2、12-mer-1.3、G23、TACL08、TGN、gHoPe2 和 E1-3，总结于表 1 中。
缩写：AMT，吸附介导的细胞转染；B-Pc-SynB1，苄基青霉素 - SynB1；D-[氨基酸]，D- 旋向氨基酸；Dal-SS-SynB1，D- 精氨酸 - SS - SynB1；GABA-CTP，γ-氨基丁酸 -细胞质转导肽偶联物；GM1，单唾液酸四己糖神经节苷脂；GSH-MEM，谷胱甘肽-美维特；K 通道，钾通道；LDLR，低密度脂蛋白受体；LRP-1，低密度脂蛋白相关蛋白 1；LRP-2，低密度脂蛋白相关蛋白 2；N/A，不可用；nAchR，烟碱型乙酰胆碱受体；TfR，转铁蛋白受体；TP10-DA，TP10-多巴胺；Van-PEG-TP10,万古霉素 - 聚乙二醇
3.3 | 源自神经营养蛋白和病毒的 BBB 穿梭肽
一些血脑屏障（BBB）穿梭肽源自内源性神经营养蛋白。通过序列比对、合成片段的筛选或涉及X射线和核磁共振（NMR）的结构研究，可以鉴定出负责血脑屏障运输的肽段（图3(b)）。例如，使用核磁共振技术，已证明载脂蛋白E（ApoE）蛋白的序列基序与血脑屏障上的受体LRP-1转运蛋白相互作用，并负责脑转胞吞作用。某些神经营养病毒已知具有穿过血脑屏障并到达脑实质的能力。源自HIV-1的TAT肽（表1）等肽载体可以穿过脑内皮细胞运输不同的货物。时间源自 2 型登革热病毒衣壳蛋白的肽α-螺旋结构域 PepH3（表 1）通过基于核磁共振（NMR）的技术得以鉴定，并且通过 AMT 机制显示出良好的脑部穿透能力。
为了优化血脑屏障（BBB）穿梭肽，需要进行化学修饰和优化，以改善它们的物理化学性质、运输渗透性或配体-受体结合亲和力。优化过程包括减少肽上的氢键单位、调整LogP值，或从天然氨基酸转变为非天然氨基酸或肽类，以使它们对蛋白酶更稳定。将D-对映体氨基酸的整合是增强对蛋白水解酶降解抵抗性的有效方法，因为酶对L-肽键具有底物特异性。例如，（PhPro）4 [(Phenylproline)4-NH2]和二酮哌嗪（表1）被开发出来以增加水溶性和血脑屏障渗透性。这些肽的分子量小于500道尔顿，通过被动扩散穿过血脑屏障的潜力更大。与（N-MePhe）4肽相比，（PhPro）4的溶解性增加了1000倍，渗透性也显著增加。一个12个残基的血脑屏障穿梭THR（THRPPMWSPVWP；表1）在血清中显示出低稳定性。反式-消旋版本的 THR（THRre）被制造出来以增强稳定性；对含有两个共价连接肽的支化 THRre 肽的进一步修饰使血脑屏障（BBB）的运输能力提高了 2.6 倍。Eriste 等人通过将 CPP pVEC (LLIILRRRIRKQAHAHSK-NH2) 与通过光动力疗法（PDT）发现的针对神经胶质瘤的肽 gHo (H2NQQQNPHQPPM-NH2) 偶联，合理地设计了一种血脑屏障穿梭融合肽载体 gHoPe2（表 1）。将 PDT 用于发现新肽和 CPP 以增强细胞摄取的联合方法，产生了一种在颅内肿瘤中积累的优化的 gHoPe2 肽，而 gHo 肽则没有。
4 | 脑穿透肽的常见作用靶点
4.1 | 转铁蛋白受体
转铁蛋白受体（TfR）是血脑屏障（BBB）中RMT通路的一个特征明确的受体，是一种膜糖蛋白受体，介导铁结合蛋白转铁蛋白的运输，并作为调节铁摄取和稳态的守门员。尽管TfR存在于脑毛细血管内皮细胞、脉络丛上皮细胞、神经元，可能还有神经胶质细胞上，但它主要在肝细胞和红细胞中表达；因此，TfR并非血脑屏障所独有。大多数类型细胞上TfR的表达水平取决于铁的供应水平及其增殖率。TfR介导的转胞吞作用过程允许循环铁结合转铁蛋白通过血脑屏障并进入脑间质空间，这与胰岛素和胰岛素样生长因子通过血脑屏障的胰岛素受体运输到大脑的方式类似。恶性细胞由于其生长需要高水平的铁，因此TfR的表达水平升高。因此，转铁蛋白已被用作载体或靶向配体，将抗癌药物、纳米颗粒、蛋白质和基因递送至过度表达转铁蛋白受体的增殖癌细胞。与转铁蛋白受体结合的抗体已被证明能够选择性地靶向血脑屏障内皮细胞。OX-26是一种大鼠转铁蛋白受体单链抗体，已被成功用于跨越血脑屏障递送聚合物体和纳米颗粒。与单独静脉给药相比，通过将OX-26与治疗剂结合，脑部药物浓度显著提高。具有优化与转铁蛋白受体结合的双特异性抗体，可靶向β-分泌酶，能够穿过血脑屏障并减少小鼠脑部淀粉样蛋白-β（Aβ）。一种由工程化为与转铁蛋白受体结合的蛋白质片段与抗β-分泌酶抗原结合片段（Fab）融合而成的运输载体，可显著增强小鼠和大鼠的脑部运输和中枢神经系统反应。人们发现诸如 THR、CRT 和 HAI 等 BBB 穿梭肽（表 1）以转铁蛋白受体（TfR）为靶点。
4.2 | 低密度脂蛋白受体
低密度脂蛋白受体（LDLR）介导富含胆固醇的低密度脂蛋白（LDL）的内吞作用，并已被广泛研究用于将蛋白质和治疗药物穿过血脑屏障（BBB）运输至中枢神经系统（CNS）。LDLR 在支气管上皮细胞以及肾上腺和皮质组织中表达最为显著。它在血脑屏障以及各种肿瘤细胞（如神经胶质瘤细胞）中也高度表达。源自 LDLR 结合位点的载脂蛋白 B（ApoB）和载脂蛋白 E（ApoE）肽（表 1）已被证明在中枢神经系统疾病中对 LDLR 靶向治疗有效，尽管与内源性 LDL 竞争以及扰乱大脑中的胆固醇稳态一直是一个令人担忧的问题。通过噬菌体展示生物筛选法开发的 Peptide-22（表 1）对 LDLR 有亲和力，且与内源性 LDL 无竞争，能够高效且快速地转移到中枢神经系统。
4.3 | 低密度脂蛋白受体相关蛋白 1 和 2（LRP-1 和 LRP-2）
LRP-1 和 LRP-2 是 LDLR 超家族中大型的、多功能的、多配体的内吞受体。它们介导多种配体的内化和降解，这些配体涉及各种代谢途径。LRP 受体有两个主要功能：（a）作为清道夫受体参与其众多配体的内吞作用；（b）作为信号受体调节各种细胞过程。LRP 受体与广泛的（>40 种）分泌蛋白和细胞表面驻留分子相互作用，包括载脂蛋白 E、α2-巨球蛋白（α2M）、受体相关蛋白、组织型纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂 1、淀粉样前体蛋白、乳铁蛋白和黑素转运蛋白。多年来，LRP-1 和 LRP-2 受体已被开发用于通过 RMT 途径将药物靶向到大脑。
LRP-1 受体（也称为 CD91 或α2M受体，600 千道尔顿）在包括肝脏和肺在内的多种组织中普遍表达，并参与胆固醇代谢、内吞作用和细胞信号传导。LRP-1 在整个中枢神经系统广泛表达，主要在大脑皮质、脉络丛、海马体和小脑、脑内皮细胞、血管平滑肌细胞、周细胞、活化的星形胶质细胞和小胶质细胞中。LRP-1 在恶性星形细胞瘤中过度表达，而在阿尔茨海默病中 LRP-1 的表达降低。关于 LRP-1 在大脑中的功能的大多数研究都集中在它调节淀粉样前体蛋白运输、淀粉样β从脑实质清除以及血脑屏障通透性的作用上。
LRP-2 受体（也称为 megalin）是一种 600 千道尔顿的跨膜蛋白，也是脊椎动物中存在的最大的细胞表面糖蛋白之一。LRP-2 的结构与 LRP-1 非常相似。LRP-2 主要在肾脏、膀胱和大脑中表达。在健康的大脑中，LRP-2 在大脑皮质、海马体、纹状体、丘脑、嗅球和小脑的不同神经元中表达。LRP-2 也在排列在脑室壁的室管膜细胞、毛细血管、脉络丛、神经元和星形胶质细胞中表达。在患有阿尔茨海默病的患者的脑组织中，发现 LRP-2 在受损神经元中上调。
LRP-1 和 LRP-2 在将分子运输到细胞内方面展现出了令人瞩目的能力。研究一直集中于利用 LRP 受体的货物功能，通过转胞吞作用将药物穿过血脑屏障（BBB）。已确定了针对 LRP 受体的用于脑部药物运输的肽（表 1）。据报道，聚山梨酯 80（Tween-80）包层的聚丁基氰基丙烯酸酯纳米颗粒在静脉注射后能从血液中吸附载脂蛋白 E（ApoE）和载脂蛋白 B（ApoB），并通过 LRP-1 介导的转胞吞作用途径促进血脑屏障的穿越。
4.4 | 瘦素受体
瘦素是一种16 kDa的激素，主要由白色外周脂肪细胞产生，在调节食物摄入和维持能量平衡方面发挥重要作用。瘦素还参与调节学习和记忆过程。瘦素受体已被发现存在于神经胶质细胞、星形胶质细胞、脉络丛和脑毛细血管内皮细胞中。瘦素从脂肪细胞释放到血液中，并通过与表达在脑实质中的瘦素受体相互作用而被摄取。脑内皮细胞会影响进食、产热、活动等生理和行为方面。在肥胖患者中，由于瘦素水平升高，瘦素受体可能会饱和。一种源自瘦素的肽序列g21（12-32个氨基酸；表1）片段已被用于与聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米颗粒表面结合，这些纳米颗粒在静脉注射后穿过血脑屏障，并在2小时后到达大脑，占注射剂量的0.16%。另一种源自瘦素的30个氨基酸的肽（Leptin30；表1）被开发为纳米颗粒的脑靶向配体。
4.5 | 烟碱型乙酰胆碱受体
烟碱型乙酰胆碱受体（nAchR）属于配体门控离子通道超家族，包括γ-氨基丁酸A型和C型受体、甘氨酸受体和5-羟色胺受体。nAchR介导神经和肌肉细胞之间的突触传递。nAchR对神经递质乙酰胆碱和上瘾性毒品尼古丁都有反应。nAchR主要在中枢神经系统、外周神经系统和肌肉中表达。神经元nAchR由五个跨膜亚基组成，这些亚基围绕着一个中央充满水的孔隙排列。已报道的505个氨基酸的神经毒性狂犬病毒糖蛋白（RVG）与nAchR相互作用，并被用于传递各种纳米颗粒、RNA和DNA片段。RVG衍生的29个氨基酸的肽RVG29（表1）与PAMAM（聚酰胺胺）纳米颗粒结合，在体外血脑屏障模型中显示出比传统纳米颗粒更高的血脑屏障穿越效率。另一篇报道称，一种 16 个氨基酸的 D-CDX 肽（表 1）可通过 nAchR 介导的细胞内吞作用促进脑靶向药物递送。
5 | 用于 PDCS 的 BBB 穿梭肽
尽管针对血脑屏障（BBB）上表达的转运蛋白的抗体或内源性蛋白质配体有所进步，但一些高亲和力抗体由于对受体的高度亲和力以及在大脑实质中无效的货物释放而阻碍了货物的大脑递送。此外，蛋白质的高成本生产和复杂结构限制了这些血脑屏障穿梭蛋白的广泛应用。小尺寸肽因其能够表现出出色的靶向特异性、低毒性和免疫原性，以及最小的合成和制造挑战而越来越受到关注。各种血脑屏障穿梭肽已被研究以评估其穿过血脑屏障的能力，这些肽在表1中进行了总结。一些血脑屏障穿梭肽通过利用选择性RMT通路的受体依赖机制穿过血脑屏障（图2），而一些合成或蛋白质衍生的细胞穿透肽（CPP）则通过受体非依赖机制，主要是通过AMT通路，作为大脑递送载体显示出希望。CPPs 通常由 5 至 30 个氨基酸组成，大致分为两类：高阳离子型和两亲性型。CPPs 的正电荷和两亲性是允许 CPPs 穿过生物膜并将生物活性货物驱动进入细胞的关键特征。一些 CPPs 表现出血脑屏障穿透能力。下面重点介绍了一些常用的源自 PDT、CPP 或天然蛋白质的血脑屏障穿梭肽，用于构建 PDC。
5.1 | Angiopep-2
Angiopep-2是一种19个氨基酸的肽（TFFYGGSRGKRNNFKTEEY，分子量2.3 kDa；表1），是通过将6.5 kDa的多肽aprotinin（LRP-1和LRP-2的配体）与其他人类蛋白质（包括bikunin、分泌淀粉样前体蛋白和Kunitz抑制剂-1前体蛋白）进行序列比对而开发的，这三种蛋白质都具有已知对LRP受体有亲和力的Kunitz结构域。使用体外血脑屏障牛脑毛细血管内皮细胞Transwell实验，Angiopep-2的转胞吞作用能力比aprotinin高三倍，比转铁蛋白和乳铁蛋白高50倍以上。此外，近红外荧光染料Cy5.5标记的Angiopep-2通过体内成像和脑切片的荧光分析显示，能够迅速进入脑实质（图4(a)）。Cy5.5-Angiopep-2（红色）位于脑实质中。
在静脉注射后 1 小时，观察到荧光标记的 Angiopep-2（绿色）靠近脑细胞的细胞核（蓝色），而 Cy5.5-Angiopep-7（阴性对照）未穿过脑毛细血管（绿色；图 4(a)）。通过活体成像，在静脉给药 5 天后观察到荧光标记的 Angiopep-2（绿色）在活体小鼠大脑的脑膜和实质中的积累（图 4(b)）。在静脉给药后 30 分钟至 24 小时的时间范围内，体内小鼠大脑成像显示 Cy5.5-Angiopep-2 在大脑中的积累显著高于 Cy5.5-Angiopep-7。Cy5.5-Angiopep-2 荧光的 AUC 值比 Cy5.5-Angiopep-7 高 9.5 倍，表明 Angiopep-2 对大脑的选择性摄取（图 4(c)）。Angiopep-2 的最初应用侧重于化学合成 Angiopep-2 小分子药物偶联物，包括紫杉醇、依托泊苷、多柔比星、吗啡、吗啡-6-β-葡萄糖醛酸酯、咖啡酸和神经递质的偶联物（图 6）。随后对 Angiopep-2 的利用是将载体（如纳米粒子、胶束、碳纳米管和抗体）进行改造，以便向大脑输送药物，这支持了血脑屏障穿梭蛋白 Angiopep-2 在为各种中枢神经系统疾病输送小分子和大分子方面的通用性。
5.2 | 针对 LRP-1、LRP-2 和 LDLR 的肽
一种 18 个残基的载脂蛋白 E 肽段和一种 39 个残基的载脂蛋白 B 肽段（表 1）源自内源性神经趋向的载脂蛋白 E 和载脂蛋白 B 蛋白，通过与大脑中的低密度脂蛋白受体相互作用显示出血脑屏障穿透效果。最新的噬菌体展示生物筛选还发现了几种血脑屏障穿梭肽，包括针对低密度脂蛋白受体的 Peptide-22、VH4127、LRPep2 和 AEP 肽，以及针对 LRP-1 受体的 L57 肽（表 1）。
5.3 | 针对转铁蛋白受体（TfR）的肽
通过噬菌体展示生物筛选过程，发现了一个 12 个残基的 THR 肽（THRPPMWSPVWP）和一个 7 个残基的 HAI 肽（HAIYPRH；表 1）是人类转铁蛋白受体的结合肽。融合绿色荧光蛋白（GFP）的转铁蛋白受体（TfR）肽可以被转铁蛋白受体表达细胞内化。血脑屏障穿梭 THR 肽已与金纳米粒子（AuNP）偶联，以增加纳米粒子在大鼠大脑中的渗透。THR 肽能够与腺相关病毒 AAV8 病毒体结合，并显著增强它们穿过血脑屏障和转导神经元细胞的能力。血脑屏障穿梭 HAI 肽偶联的脂质体在脑胶质瘤小鼠模型中改善了递送和治疗效果。HAI 肽能够将 AuNP 递送到大鼠大脑，并且比 THR 肽显示出更好的运输能力。另一种血脑屏障穿梭肽 CRT（环 CRTIGPSVC 肽，表 1）选择性地与转铁蛋白受体相互作用，诱导别构构象变化，从而在功能上“模拟”铁。CRT 导向的病毒颗粒在正常小鼠大脑中显示出改善的血脑屏障渗透性，CRT 偶联的纳米颗粒在小鼠模型的神经胶质瘤实质中显示出增强的大脑分布。
5.4 | TAT 衍生肽
TAT（人类免疫缺陷病毒 1 型[HIV-1]的转导结构域）蛋白是一种 86 个氨基酸的转录因子，参与 HIV-1 病毒的复制周期，能够通过吸附内吞作用进入细胞并转移到细胞核中。从 TAT 蛋白的α-螺旋结构域中衍生出的 11 个残基的 TAT 肽（表 1）是第一种被鉴定为阳离子 CPP 的肽。TAT 肽已被证明能增加 TAT-β-半乳糖苷酶缀合物在包括大脑在内的毛细血管以外的普遍组织穿透性。各种与 TAT 缀合的纳米粒子显示出改善的大脑递送。通过将双 TAT 和 Angiopep-2 肽与紫杉醇缀合合成的 PDC 在颅内胶质瘤小鼠模型中显示出药物向大脑的转位得到改善。
5.5 | Transportan 10
Transportan 10（TP10）是一种21个残基的两亲性CPP（AGYLLGKINLKALAALAKKIL；表1），具有高膜转位能力。TP10已被用作肽核酸、肽和蛋白质的递送载体。TP10-多巴胺缀合物（图6）通过小尺寸PEG作为连接子，能够进入脑组织，对多巴胺D1和D2受体具有相对较高的亲和力，并在动物模型中显示出抗帕金森病的活性。另一种TP10-万古霉素缀合物（图6）能够穿过血脑屏障，脑组织中缀合物含量比游离万古霉素高出200倍。
5.6 | SynB
SynB 肽源自天然的抗菌肽 protegrin，属于阳离子 CPP 家族。18 个残基的 SynB1（RGGRLSYSRRRFSTSTGR）和 10 个残基的 SynB3（RRLSYSRRRF）肽（表 1）已被证明可通过吸附介导的内吞作用增强药物穿过血脑屏障的运输。L-SynB1、L-SynB3 及其对映异构体 D-SynB3 与阿霉素偶联（图 6），偶联物使阿霉素的大脑摄取量显著增加约 30 倍。。SynB1 还能增强苄西林或吗啡-6-葡萄糖醛酸酯在大脑中的作用，且不会损害血脑屏障的完整性。SynB1 肽通过二硫键连接子与 dalargin 连接（图 6），该缀合物显著改善了 dalargin 在大脑中的递送和镇痛活性。
5.7 | Penetratin
Penetratin 是一种 16 个残基的阳离子 CPP（RQIKIWFQNRR-MKWKK，也称为 pAntp-(43-58)），源自果蝇触角足蛋白（氨基酸 43-58；表 1；）。Penetratin 通过吸附介导的内吞作用显示出细胞穿透特性。Penetratin 已被用作各种货物（如 GFP、寡核苷酸和脂质体）的细胞内递送载体。与聚赖氨酸（高精氨酸含量的 CPP）功能化的纳米粒子相比，Penetratin 功能化的聚合物纳米粒子显示出显著增强的大脑摄取，并减少在非靶组织中的积累。转铁蛋白 - Penetratin 修饰的脂质体改善了质粒 ApoE2和质粒β-半乳糖苷酶的大脑递送。阿霉素 - D-Penetratin 缀合物（图 6）显示阿霉素的大脑摄取量高出 6 倍。
5.8 | 细胞质转导肽
细胞质转导肽（CTP）是一种 11 个残基的阳离子 CPP（YGRRARRRRR；表 1），经过合理设计，能够穿过细胞膜，并优先聚集在细胞质中。CTP 偶联的 Smac/DIABLO 肽和 CTP 融合的β-半乳糖苷酶能够有效地进入细胞的细胞质腔室。CTP 偶联的神经递质γ-氨基丁酸（GABA）能够穿透血脑屏障，并提高大鼠和小鼠血浆中的 GABA 水平。
5.9 | 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽
RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）肽靶向αvβ3整合素，由于αvβ3整合素在新生血管中过度表达，尤其是在脑瘤中，因此已被广泛用作脑部药物递送载体。已报道 RGD 肽修饰的聚合物、放射性标记肽、胶束和脂质体在胶质母细胞瘤的诊断和治疗中很有用。这些 RGD 纳米粒子被认为通过内化进入白细胞来介导间接细胞内吞作用，白细胞会响应炎症被招募到大脑中。RGD-PEG4-Suc-PD0325901（一种 MEK1/2 抑制剂）偶联物（图 6）在治疗 U87MG 胶质母细胞瘤小鼠异种移植物方面显示出优越的治疗效果，表明该药物有望实现脑部递送。
5.10 | 谷胱甘肽
谷胱甘肽（L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酸-甘氨酸，GSH，表1）是活细胞中最丰富的（细胞内高达10 mM，循环中5 μM）小分子量硫醇，它具有从解毒到保护免受氧化损伤等一系列功能。内源性GSH被确定为血脑屏障穿梭肽，这可以通过在颈动脉注射后，大鼠大脑对35S标记的GSH的饱和摄取过程来证明。将GSH作为血脑屏障穿梭肽用于向大脑递送药物的最成功例子是G-Technology®。钠依赖性谷胱甘肽-PEG脂质体被证明能够向大脑递送抗病毒药物。GSH还与N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂memantine（MEM；图6）共价连接，用于向大脑递送药物。
5.11 | 聚精氨酸肽
聚精氨酸肽，如R8、R11和R18，是富含精氨酸的CPPs，在生理条件下会质子化，并与磷脂膜的带负电荷的羧基、硫酸盐和磷酸基团相互作用，导致膜结构扭曲，并引发亲水性水孔在膜中迁移，从而引发非受体依赖性细胞内吞。聚精氨酸CPPs可以促进包括核酸、活性蛋白、量子点和纳米颗粒等分子货物穿过膜的运输。八精氨酸（R8；表1）、D-R8和R11已被用作血脑屏障穿梭肽，用于向大脑递送药物。R8和D-R8在静脉联合给药D-R8和胰岛素混合物后，显示增强了胰岛素在大鼠大脑深处的摄取和积累。R11肽（表1）可以穿过正常的完整血脑屏障，到达皮质、纹状体和丘脑。R11 介导的脑部递送在系统给药后长达 8 小时的缺血小鼠大脑中得到了极大增强。R18 和 D 型抗原 D-R18 在不同啮齿动物中风模型中显示出神经保护特性，通过减轻缺血性脑损伤的严重程度和改善功能结果。这些发现表明，聚精氨酸肽是很有前景的载体，用于跨越血脑屏障递送治疗药物，具有潜在的神经保护作用。
6 | 穿透大脑的PDC
抗体药物偶联物（ADC）的靶向治疗已进入临床应用，这代表了通过靶向部分抗体选择性地向肿瘤输送“神奇子弹”这一概念的成功。可以设计出更小的分子大小的肽，以选择性地与细胞表面靶点结合，并识别患病组织的独特分子靶点。PDC 旨在通过化学连接子将靶向肽与治疗有效载荷连接起来（图 5），是 ADC 的替代品，有可能扩大各种药物的治疗潜力。在血脑屏障（BBB）穿越和靶向中枢神经系统疾病的情况下，PDC 旨在劫持内源性 BBB 流入运输机制，并将药物偷运到脑实质中。治疗剂可以通过化学方法与 BBB 穿梭肽偶联。
图 5 肽药物偶联物（PDC）的结构以及常用的连接子和代表性的药物有效载荷。PABC 表示对氨基苄氧羰基。药物偶联位点以红色圆圈显示。
与抗体药物偶联物（ADCs）相比，低分子量的肽偶联药物（PDCs）可能导致更均匀的位点特异性化学偶联、增强对固体组织的渗透、有效的细胞运输，以及更简便的合成和纯化。PDC 的一个潜在缺点是，对肽和治疗剂的化学修饰可能导致期望的中枢神经系统（CNS）活性的丧失。此外，通过与亲脂性肽偶联来增加分子的亲脂性也可能导致成为外排泵（如 P-gp）的底物，例如 Gabathuler（2010 年）。影响 PDC 作为血脑屏障（BBB）可渗透分子载体和有效治疗药物成功的主要因素包括：（a）PDC 向大脑运输的速度，（b）有效载荷向大脑释放和递送的程度，（c）脑内药物分布的药代动力学，（d）活性药物对 CNS 靶点调节的药效学，（e）与内源性蛋白质或肽对 BBB 转运蛋白的竞争；(f) 与有效载荷释放相关的连接体化学特性以及细胞外和细胞内稳定性，以及 (g) 治疗剂的选择，包括效力、作用机制和可修饰的功能基团。仔细微调 PDC 的特性，以平衡血脑屏障运输和有效载荷的中枢神经系统活性，对于实现 PDC 作为非侵入性血脑屏障递送策略的潜力至关重要。
图 6 脑穿透性 PDCs（肽：黑色，连接子：红色，治疗有效载荷：蓝色）的结构。血脑屏障穿梭肽包括 Angiopep-2、SynB1、SynB3、Penetratin、TP10、RGD、gHoPe2、GSH 和 E1-3。治疗有效载荷包括紫杉醇、依托泊苷、阿霉素、吗啡、吗啡-6-β-葡萄糖醛酸酯、咖啡酸、PD0325901、苄基青霉素、万古霉素、多巴胺、美金刚（MEM）、达拉精和神经递质。
在这篇综述中，我们研究了血脑屏障穿梭肽和脑穿透性 PDCs 作为非侵入性药物递送系统，用于将化疗药物和其他分子货物穿过限制性的血脑屏障。早期的血脑屏障穿梭肽，如细胞穿透肽，主要利用选择性较差的吸附介导的转胞吞作用来改善穿过血脑屏障的运输，而通过噬菌体展示技术或从天然神经营养蛋白中发现的新型肽则利用受体介导的转胞吞作用分子机制来穿过血脑屏障。
