Linker在构建重组融合蛋白时重要性

连接作用：Linker作为两个融合蛋白间起连接作用的氨基酸链，具有一定的柔性以允许两侧的蛋白完成各自独立的功能。这对于保持融合蛋白的生物活性至关重要。

防止不良结果：如果没有Linker，直接融合的功能区域可能会导致融合蛋白的错误折叠、产量低或生物活性受损等问题。

影响三元复合物的形成：在PROTAC技术中，Linker的长度显著影响POI-PROTAC-E3三元复合物的形成，最佳的Linker长度取决于三元复合物的相互作用模式、距离和空间结构。

影响理化性质和药代动力学：Linker的化学组成直接影响了PROTAC的理化性质，这些性质反过来影响了PROTAC的细胞通透性，从而显著影响了PROTAC的生物降解效率。

提高生物活性：Linker的插入适当改变了不同蛋白结构域间的距离，以减少他们之间的相互影响，恢复或改善折叠，最终提高生物活性。

影响融合蛋白PK：Linker的特性直接影响着偶联药物的治疗指数、疗效、安全性与药代动力学。

设计和优化：Linker的设计需要考虑多个因素以确保其功能性和稳定性，在工艺生产方面同样需要考虑多种要素。

提供额外功能：在蛋白质药物设计中，Linker还能提供许多额外功能，如增加产量、实现可控或靶向给药，以及获得理想的药代动力学结果。

综上所述，Linker在重组蛋白构建中扮演着至关重要的角色，它不仅连接不同的蛋白结构域，还影响着融合蛋白的生物活性、稳定性和药代动力学特性。合理设计Linker对于成功构建重组蛋白和实现其预期功能至关重要。

氨基酸的选择

在选择天然Linker的氨基酸时，应考虑其长度、溶解性、氨基酸组成和二级结构特征。通常，天然Linker中偏好的氨基酸是极性且可带电的残基，它们约占总氨基酸的50%。Pro、Thr和Gln被认为是理想的天然Linker氨基酸。Pro因其环状侧链而独具一格，这使其结构相当受限制。

在天然Linker中，氨基酸的选择非常关键，因为它们直接影响到Linker的功能和融合蛋白的稳定性。以下是一些在选择天然Linker中常用的氨基酸及其特性：

甘氨酸（Gly）：甘氨酸是所有氨基酸中最小的，没有手性碳，因此柔性最好。它经常被用作Linker，因为它不会对两侧蛋白的构象和功能产生影响。例如，(GGGGS)序列就是一个常用的Linker，其中包含了多个甘氨酸残基以提供柔性。

丝氨酸（Ser）：丝氨酸也是构建柔性Linker的常用氨基酸之一。它提供了柔软度，并且可以通过与水分子形成氢键来保持Linker在水溶液中的稳定性，减少与蛋白功能域之间的不利相互作用。常见的柔性Linker序列如(G4S)n，即甘氨酸和丝氨酸的组合，通过调整序列中甘氨酸和丝氨酸的比例，可以优化Linker的长度，实现蛋白功能域的适当分离或保持必要的域间相互作用。

谷氨酸（Glu）和赖氨酸（Lys）：这些氨基酸可以提高水溶性，并且在一些特定的Linker序列中使用，如在单链可变片段（scFv）中连接重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的Linker，通常包含这些氨基酸以提供额外的功能。

脯氨酸（Pro）：脯氨酸可以增加Linker的骨架硬度，并且有效分离结构域。富含脯氨酸的序列在机体中广泛存在，例如(Ala-Pro)7的结构。脯氨酸的加入可以使得Linker表现出相对坚硬的结构，有效地将两端的蛋白结构域分开。

在选择Linker中的氨基酸时，研究人员会考虑Linker的长度、氨基酸的化学性质（如疏水性、电荷效应）、以及它们对融合蛋白结构和功能的影响。理想的Linker应该在保持连接蛋白结构域的独立性和功能的同时，减少不利的相互作用。

Linker的构象

天然Linker在二级结构中通常采用多种构象，包括螺旋β 链、盘绕/弯曲以及转角等，来实现其功能。大多数Linker呈现为α-螺旋或线圈/弯曲的二级结构。

螺旋结构Linker：α-螺旋结构以其稳定性和刚性著称，内部氢键和紧凑的骨架赋予其这些特性。在折叠过程中，某些α-螺旋构象能够迅速形成，帮助连接的蛋白质结构域正确折叠并避免与Linker发生不必要的相互作用。此类Linker还可作为刚性隔板，有效分隔蛋白质结构域，从而减少它们之间的干扰。

非螺旋结构Linker：由于缺乏固有的刚性结构，非螺旋Linker通常富含Pro，这可能增强Linker的刚性。因此，富含Pro的非螺旋Linker可能表现出较为坚硬的特性，有助于减少结构域间的干扰。

扩展构象：天然Linker通常需要采用扩展构象的接头序列，以实现最大的灵活性。这种扩展构象有助于保持连接的蛋白结构域之间的独立性和功能。

柔性Linker：柔性Linker一般由小的非极性（如Gly）或极性（如Ser或Thr）氨基酸组成。这些氨基酸的小尺寸提供了灵活性，并使连接的蛋白功能域具有一定的移动能力。加入Ser或Thr可以通过与水分子形成氢键来保持连接体在水溶液中的稳定性，从而减少连接体与蛋白功能域之间的不利相互作用。

刚性Linker：与柔性Linker相对的是刚性Linker，它们通常包含脯氨酸等氨基酸，这些氨基酸可以增加Linker的骨架硬度，并且有效分离结构域。

可裂解Linker：某些Linker设计为可裂解的，这意味着它们可以在特定的环境条件下（如在肿瘤细胞内部）被裂解，从而释放出连接的分子。这种类型的Linker在药物设计中尤为重要，例如在抗体偶联药物（ADC）中，Linker需要在肿瘤细胞处可以裂解将毒素释放。

螺旋形式的Linker：有些研究中提到螺旋形式的Linker肽，如[A(EAAAK)nA]，这种形式的Linker可以提供一定的结构稳定性，同时允许两个融合蛋白结构域之间有一定的分离。

低疏水性、低电荷效应的氨基酸组成的Linker：这种Linker能够充分伸展以分开两种融合的组分，使之能在互不干扰的情况下充分折叠成各自的天然构象。

Linker长度的影响：Linker的长度对融合蛋白的功能和稳定性有重要影响。过长的Linker可能导致融合蛋白对蛋白酶敏感，而长度不足则可能导致两个融合分子相距太近，影响蛋白功能。

Linker的二级结构：在某些研究中，通过软件分析预测了Linker的二级结构，发现Linker部位具有很低的抗原性，亲水性无改变，Linker部位呈中性且柔性良好，不影响两端蛋白质二级结构和融合蛋白空间构象。

Linker通常采用延伸的构象形式，并保持独立的结构，从而避免与邻近的蛋白质结构域相互作用。其长度、组成、亲水性以及二级结构对于实现预期功能而言都至关重要。

Linker的选择

当连接的结构域需要一定的运动或交互时，柔性Linker是理想的选择。它们通常由小型非极性氨基酸（如Gly）或极性氨基酸（如Ser或Thr）构成。这些氨基酸由于尺寸较小，提供了良好的灵活性，允许连接的功能域间有一定的移动。Ser或Thr能够通过与水分子形成氢键来稳定Linker在水环境中的结构，进而减少Linker和蛋白质分子之间的负面相互作用。

广泛使用的柔性Linker序列通常以甘氨酸和丝氨酸为主（“GS”），例如(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n。通过调整重复次数“n”，可以优化GS Linker的长度，以确保功能域之间的适当分离或必需的交互。柔性Linker可以包含其它氨基酸（如Thr和Ala）以保持其灵活性，或极性氨基酸（如Lys和Glu）以增强溶解性。

例子包括：

EGKSSGSGSESKST，其中Gly和Ser提供灵活性，Glu和Lys提高溶解性；

(Gly)8可增加表位的抗体可达性或改善蛋白质折叠；

GSAGSAAGSGEF避免了大疏水残基，以保持良好的水溶性；

柔性Linker的长度可根据需要调整，以实现适当的折叠或优化融合蛋白的生物活性。

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