获得高产量、高纯度和高质量的外泌体是下游分析的第一步。然而，外泌体不是单一组分的囊泡，具有复杂的异质性，迫切需要开发高亲和力和高选择性的外泌体的有效分离和富集方法。经过几十年的努力，已经建立了几种方法，并成功地应用于复杂生物系统的外泌体分离，如“金标准”超离心、尺寸排除色谱、超滤和聚合物沉淀。由于这些方法基于外泌体的物理特性，很难有效区分外泌体和干扰粒子。为了提高外泌体富集的选择性，外泌体标记为开发基于标记及其相应配体之间特异性结合的基于亲和的捕获策略提供了新的思路。通过这种策略，可以有效地分离和富集表达特定蛋白质的外泌体亚型。在本节中，我们将介绍外泌体分离和富集的传统方法和新方法，并比较每种方法的优点和局限性。

2.1 传统的分离和富集策略

2.1.1 超速离心法

超离心是最被广泛接受的外泌体分离方法，通常包括差速超离心和梯度超离心。该方法可用于从大规模样品中分离外泌体，例如超过400 ml。然而，整个过程通常需要4小时以上，并且非常耗时。在差动超离心过程中，在500、2000、20000 g的不同离心力下，样品中的细胞、细胞片段和大微泡被依次去除(图1A)。随后在超离心条件下收集细胞培养基中的外泌体，数量超过1,10,000 g 。Li等人利用差示超离心技术成功地从乳腺癌患者血清中分离出外泌体。由于血清黏度高，离心力高达15万g，过夜时间较长。

在梯度超离心过程中，外泌体可以保留在密度平衡区域(1.13-1.21 g/cm3)以分离其他杂质。Paolini等人通过鉴别超离心、梯度超离心和一步沉淀试剂盒从多发性骨髓瘤患者的血清中分离出外泌体，然后评估残留污染物的存在。结果表明，梯度超离心获得的外泌体纯度高。相比之下，用差示超离心或一步沉淀试剂盒分离的外泌体被包埋外泌体的残留基质污染。残留基质阻止了外泌体与质膜的融合，从而干扰了外泌体的正常功能。一般来说，通过梯度超离心可以获得纯度较高的外泌体，而差别化超离心具有一次分离大体积样品的优点。但需要注意的是，高离心力和反复离心可能对囊泡造成不可逆的损伤。

2.1.2 排色色谱法

隔离层析(SEC)是一种从复杂样品中分离外泌体的新方法。在SEC柱中，物质在凝胶中的扩散路径是不同的。样品中的小囊泡和分子在凝胶中的路径较长，滞留时间较长，而大囊泡的路径较短，滞留时间较短。具体而言，SEC法具有良好的重复性，也可用于荧光标记外泌体的定量检测。

凝胶的选择对外泌体的分离有重要影响。Xu等人评估了几种市售SEC基质(Sepharose CL-2B、Sepharose CL-4B、Sephacryl S-100及其组合)对细胞培养基中荧光标记外泌体的分离效率。结果表明，Sepharose CL-4B色谱柱具有最佳的分离效率、分离速度和峰形。该方法从细胞培养基中分离得到的外泌体大小范围为50 ~ 300 nm，检出限为2.9 × 107粒/mL。Guo等人最近也对Sepharose CL-6B、CL-4B和CL-2B基质进行了外泌体富集研究。Sepharose CL-6B在分离蛋白血清外泌体方面优于CL-4B和CL-2B 。收集大小为200 nm的外泌体。由于CL-2B、CL-4B和CL-6B的孔径分别为75 nm、42 nm和24 nm，不同孔径的外泌体需要不同的SEC分离材料。

SEC在外泌体异质性的研究方面也做出了很大的贡献。Zheng等人开发了一种用于尿液中外泌体亚型分析的二维SEC方法。在第二次D-SEC中，尿液中的外泌体被分为三种亚型(L-Exo, M-Exo和S-Exo)(图1B)。通过液相色谱-串联质谱法分别鉴定出L-Exo中144个糖蛋白和44个磷酸化蛋白，M-Exo中156个糖蛋白和46个磷酸化蛋白，S-Exo中134个糖蛋白和10个磷酸化蛋白。这证实了三种外泌体亚型中的蛋白质具有不同的糖基化和磷酸化水平，这表明相应的外泌体可能具有不同的生物学功能。

2.1.3 超滤

囊泡的大小比多肽、蛋白质和核酸等生物分子的大小还要大。囊泡可以被不同孔径的膜拦截。聚醚砜、聚碳酸酯和阳极氧化铝可用于膜过滤器。为了解决从同一样品中分选不同大小外泌体的需要，也可以串联使用不同孔径的过滤器(图1C)。然而，膜的孔径通常较窄，在分离生物样品时容易堵塞。它也可能导致囊泡在压力下变形。

超滤具有速度快、成本低、操作方便、可批量处理等优点。基于此，超滤实现仪器自动化也是可行的。Chen等人报道了一种通过超快速分离系统(EXODUS)对各种生物流体进行高效外泌体分离的方法。在双膜滤波器结构中引入双耦合谐波振荡以产生横波。纳米多孔膜允许小分子和液体通过，而外泌体则留在中心腔室中。EXODUS将10 ml尿液的整个分离时间缩短至10 min以内，而超离心分离时间超过3 h。通过EXODUS自动化分析了113份尿液样本的外泌体转录组。根据RNA生物型分布分析，mrna(33.1%)、长链非编码RNA(21.9%)和假基因(21.7%)是最丰富的生物型。

2.1.4 聚合物沉淀

基于聚合物的共沉淀法也是商业外泌体分离试剂盒的常用策略，如ExoQuickTM(美国System Biosciences公司)、ExoPrep(爱沙尼亚HansaBioMed公司)和Total exosome IsolationTM(美国Invitrogen公司)。在各种亲水性聚合物中，聚乙二醇(PEG)作为沉淀剂被广泛使用。亲水性PEG可以与外泌体周围的水分子相互作用，形成疏水微环境。在此过程中，外泌体的溶解度降低，在低速离心下会有外泌体沉淀。这些商业化试剂盒产量高，易于适应不同的研究。同时，该方法避免了昂贵的超离心操作，减少了对囊泡的损伤。但值得注意的是，聚合物沉淀的过程也可能使蛋白质、核酸和脂质共沉淀。纯度是下游分析过程中可能引起干扰的重要因素。因此，开发一种高纯度、高产率的外泌体提取试剂盒具有十分重要的意义。表1总结了上述外泌体分离和富集策略的机制、优势和局限性。

2.2 新的分离和富集策略

外泌体广泛分布于复杂的生物系统中，其中存在许多干扰颗粒，如脂蛋白颗粒、蛋白质聚集体和与外泌体大小和结构相似的微囊泡等。如表1所示，基于外泌体物理性质的分离方法通常特异性较低。因此，如何有效区分外泌体与干扰粒子是一个需要解决的关键问题。同时，生物样品往往是珍贵的，难以获得，这使得从小体积样品中分离外泌体是一个很大的挑战。因此，基于亲和的捕获策略、微流控芯片、分子印迹聚合物、不对称流场-流分选等技术逐渐建立起来。

2.2.1 生物聚合物亲和捕获

亲和捕获策略在外泌体的分离和富集方面具有吸引力。由于抗体的高亲和力和优异的特异性，抗体是最常用的识别工具。一般认为，某些跨膜蛋白(如CD9、CD63和CD81)在外泌体表面高度表达。Ning等人描述了一种检测方法，通过抗体与外泌体表面蛋白CD81的相互作用，直接从COVID-19患者血浆中捕获外泌体。然后引入含有逆转录酶试剂的脂质体，实现对SARS-CoV-2 RNA的超灵敏检测。在非人类灵长类动物模型感染后1天早期检测到SARS-CoV-2 阳性外泌体。同时，该方法为COVID-19患者的诊断提供了有力的工具。此外，肿瘤来源的外泌体也被鉴定含有相应的肿瘤生物标志物，如EpCAM、PD-L1和EGFR。Li等人建立了一种基于微珠辅助流式细胞术的疾病诊断策略。用醛珠富集外泌体，利用相应抗体进行流式细胞术检测疾病标志物。利用这些策略，他们成功地实现了对乳腺癌和侵袭性无功能垂体腺瘤的高度敏感诊断。

虽然抗体在外泌体分离中显示出高亲和力和优异的特异性，但抗体也有一定的局限性，如制备工艺复杂、成本昂贵、稳定性不高。与抗体相比，适体和肽具有化学合成容易、修饰灵活、稳定性高等优点，扩大了它们在外泌体分离和富集方面的应用。Li等人用CD63-aptamers修饰微珠，开发了一种新的热电泳适配体传感器，用于外泌体的分离和检测(图2B)。在这个过程中，样品中的外泌体首先被cd63适体捕获到微珠表面。然后，利用红外激光进行局部加热，使微珠定向富集。利用该平台，可以区分乳腺癌患者和健康献血者，准确率高达97%。该策略也成功应用于转移性乳腺癌的治疗反应和前列腺癌的分类。Chang等人报道了一种基于cd63 -适配体的磁性石墨烯复合材料，可实现细胞培养基中外泌体的便捷捕获和高效富集。然后将制备的复合物用于分析MCF-7和mcf - 10a衍生的外泌体的代谢物组成，共鉴定出119种代谢物。与MCF-10A外泌体相比，MCF-7外泌体中43和42种代谢物上调和下调。

在囊泡的生物发生过程中，磷脂酰丝氨酸受翻转酶的调控，分布在外泌体的外膜中。因此，高表达的磷脂酰丝氨酸也可以作为外泌体分离的靶标。TiO2常被修饰在磁珠表面，通过Ti-PO3-Ti的非共价键分离外泌体。此外，磷脂酰丝氨酸还可以特异性结合Tim4蛋白，并被鉴定为Ca2+依赖性。用Tim4固定的磁珠可以快速捕获外泌体，并且完整的外泌体可以很容易地被螯合剂洗脱。Zhang等人开发了一种新的Tim4@ILI-01免疫亲和薄片材料，用于从血清中富集外泌体(图2A)。洗脱的外泌体基因分析表明，CD44基因的表达水平在肺腺癌患者中显著升高。通过伤口愈合实验，捕获的外泌体比未转染的细胞显著诱导更多的迁移，并且上皮-间充质过渡相关蛋白的表达在细胞迁移过程中显著改变。由于磷脂酰丝氨酸并非外泌体所独有，在其他囊泡(如微囊泡)中也存在，因此该方法的特异性仍有待评估。

2.2.2 分子印迹技术

分子印迹聚合物(molecular imprinting polymers, MIPs)作为一种人工抗体，具有特异性高、化学稳定性好、可定制通用性强等独特优势。形状、大小和空间匹配在MIPs与外泌体的识别过程中起着不可或缺的作用。Yang等人报道了一种用于小细胞外囊泡(sev)无抗体磁分离的表面印迹技术。结合在磁珠上的sev通过温和的超声处理很容易被去除，并且可以通过印迹孔分离出囊泡。与超离心(超过4小时)相比，MIPs在20分钟内表现出更高的捕获率，sEVs的富集量是sEVs的3倍。在表型分析中，sEVs上的CD24和EpCAM高度过表达，为实时无创监测小鼠肿瘤发展提供了有效的预测工具。Mori等人报道了一种基于分子印迹的抗体共轭纳米空腔。泪液中的外泌体通过抗体和纳米孔的双重识别被捕获到MIPs表面。MIPs成功地用于区分泪滴中正常外泌体和前列腺癌患者的外泌体。然而，当外泌体作为外泌体印迹的模板时，通常难以合成具有均匀孔径的MIPs。此外，在聚合过程中，外泌体的完整性和表面性质可能被破坏。为了克服这些缺点，二氧化硅纳米颗粒被用于模拟外泌体，旨在创建具有均匀孔径的MIPs(图2D)。计算出MIPs与外泌体的表观解离常数为2.4 × 10-16 mol/L，比商业免疫分析法低近1000倍。眼泪中的外泌体被成功捕获并用于乳腺癌的非侵入性诊断。尽管如此， MIPs 的制备路线仍然相对复杂，需要多步化学改性。同时， MIPs 的可重复性和亲和力有待提高。

2.2.3 微流控技术

传统的外泌体分离纯化方法往往需要大量的样品，操作复杂，耗时长。微流体作为一种新技术，可以在微管中操纵微小的流体(从几微升到几百微升)。微流控芯片具有分离速度快、通量高、所需样本量少的独特优势，非常适合从少数珍贵的生物样品中分离外泌体。

抗体、适体或肽通常在微流控通道中修饰，以增加外泌体分离的特异性。此外，为了增加外泌体与抗体、适体或肽之间碰撞的机会，人们合理设计了各种形状的微管用于外泌体富集，如捕获微通道、y形微柱和纳米线。它们的结合将有助于提高外泌体分离的选择性和效率。Yu等人报道了一种高度集成的外泌体分离和检测芯片(ExoSD)，该芯片用抗cd63抗体修饰。从细胞培养上清和胃癌患者(I期和II期)的临床血清中有效分离出外泌体。为了分离Ewing肉瘤来源的外泌体，Dong等人开发了一种特异性纯化系统，该系统采用硅纳米线嵌入微芯片与抗体结合(图2C)。纯化的外泌体可以通过二硫裂解完整地释放，并再次被受体细胞内化，在体内转移其RNA货物，以显示其在细胞间通讯中的潜在作用。

此外，单细胞来源外泌体的分离和分析仍然是一个科学问题。Zhu等人设计了一种微孔阵列芯片来捕获单细胞，抗体包被的玻片可以捕获单细胞分泌的外泌体。每个细胞分泌外泌体的数量通过结合金纳米粒子增强银染色来量化，这反映了单个细胞分泌外泌体的能力。细胞系中极少数细胞(2-3%)分泌外泌体的速度比其他细胞快60 - 80倍。如果将这些细胞排除在外，分泌的外泌体总数将减少2/3。这一策略也将为研究其他消耗最小的珍贵和稀有细胞(如循环肿瘤细胞)提供有力的工具。

2.2.4 非对称流场-流分馏

非对称流场-流分选(AF4)是一种强大的分选技术，具有很大的灵活性，可以分离大尺寸范围的样品，如蛋白质、病毒、脂质体和各种聚合物。与超离心和超滤相比，AF4无需高离心力和压力即可轻松获得完整的细胞外囊泡。通过使用AF4, Zhang等人鉴定了两种外泌体亚型(大外泌体囊泡，90-120 nm和小外泌体囊泡，60-80 nm)，并发现了大量被称为“外泌体”的非膜纳米颗粒(~ 35 nm)。与外泌体相比，外显子具有独特的n -糖基化、蛋白质、脂质、DNA和RNA谱。这些亚群被证明具有不同的器官生物分布，发挥不同的生物学功能。然而，在目前的研究中，AF4用于外泌体的分离通常持续时间长，并且受昂贵设备的限制。

2.2.5 脂质体融合技术

脂质体和外泌体具有相似的膜结构，双层膜的流动性使脂质体和外泌体能够融合。这一原理也被应用于外泌体的分离和含量分析。Liu等人设计了一种抗体修饰的脂质贴片芯片，用于快速捕获癌症细胞外囊泡。结合外泌体成功地与脂质层融合，将内容物捕获到微阵列的表面。困在脂质斑块中的RNA货物为下游分析提供了很高的潜力。

3 肽识别引导外泌体研究新策略

分子识别几乎涉及生命过程的每一个环节，在生命的生长、发育、代谢、衰老过程中起着重要作用。抗体作为一种经典的分子识别工具，已广泛应用于靶分子的识别和研究。同时，多肽是生命中最重要的生物分子之一，是由各种氨基酸脱水形成的。与生物大分子相比，多肽具有稳定性高、性质多样、制备方便等独特优势。固相合成策略的快速发展为多肽的自动批量合成和位点特异性化学修饰提供了极大的便利。
近年来，肽在外泌体研究中的应用受到越来越多的关注。通过合理设计和筛选多肽库，获得外泌体锚定肽。外泌体靶向肽的序列和靶标见表2。具有高结合亲和力和选择性的外泌体靶向肽被成功地应用于外泌体的高效分离和富集。此外，与肽偶联的货物分子可以很容易地通过非共价方式修饰为外泌体，这在药物传递和疾病治疗中起着巨大的作用。

3.1 基于肽识别的外泌体分离与富集

为了获得新的外泌体靶向肽，可以选择外泌体中高表达的分子作为靶点，如跨膜蛋白(CD9、CD63或CD81)、肿瘤标志物和生物膜上的磷脂酰丝氨酸。Gao等选取CD63细胞外第二环作为靶点，通过噬菌体展示技术获得高亲和力外泌体靶向肽CP05。CP05能有效结合外泌体表面(结合效率高达88.7%)而不改变外泌体原有的性质。当CP05固定在探针上时，每毫升血清中可有效捕获108.98±7.82 μg的外泌体。对于另一个外泌体标记蛋白CD9, Suwatthanarak等人设计并合成了一个微孔阵列的候选肽库，其中的肽序列来源于CD9的伴侣蛋白EWI-2。筛选到一个靶向cd9的肽P238，解离常数为4.66 × 10-7 mol/L。为了进一步探索P238与CD9的结合机制，我们对P238进行了逐个位点的丙氨酸替换。结果表明，取代精氨酸、组氨酸和丝氨酸后，其结合能力明显下降。这也表明静电和极性在P238与CD9的结合中发挥了重要作用。

此外，肿瘤靶向肽可以从众多外泌体中准确定位肿瘤来源的外泌体，为肿瘤的早期诊断提供了有力的工具。Sun等人设计了一种电化学传感器，将EPGR靶向肽与Zr-MOFs结合，用于定量胶质母细胞瘤外泌体。检测范围为9.5 × 103 ~ 1.9 × 107粒/μl，检出限为7.83 × 103粒/μl。胶质母细胞瘤患者外泌体的信号明显高于健康样本，这与胶质母细胞瘤源性外泌体中EGFR的表达高于正常细胞一致。
热休克蛋白(HSP)在外泌体中高度表达。当热蛋白靶向肽Vn96与外泌体结合时，可能会改变外泌体的亲水性，降低外泌体的溶解度。受这一原理的启发，Bijnsdorp等人设计了一种新的外泌体分离试剂盒，通过低速离心获得外泌体。利用Vn96出色的结合能力，Bathini等人提出了一种免疫亲和芯片，用于从MCF-7细胞培养基中捕获外泌体。添加200 μl MCF-7细胞培养基时，分离效率可达90%左右。

此外，曲率靶向肽和磷脂酰丝氨酸靶向肽也被报道用于外泌体的分离和富集。富含正电荷氨基酸(如精氨酸)的曲率靶向肽(BP)可以通过静电相互作用与带负电荷的外泌体膜结合。同时，二级螺旋结构可以诱导肽嵌入到膜的缺陷中，从而增加了肽的锚定能力。Gori等人设计了一个用曲率靶向肽修饰的微阵列平台，无需预处理即可从血清中分离外泌体。荧光成像结果显示，捕获的外泌体颗粒大小为50-120 nm，富含CD63、CD81和CD9。

3.2 靶向治疗的肽工程外泌体

自首次临床试验用于治疗转移性黑色素瘤患者以来，外泌体在药物传递和疾病治疗领域受到越来越多的关注。作为药物传递和疾病治疗的平台，外泌体具有几个显著的优势。首先，归巢效应是外泌体相对于脂质体的独特优势。肿瘤源性外泌体对肿瘤细胞具有天然的靶向能力。其次，外泌体的膜保护内容物不释放到循环系统中。外泌体与靶细胞膜融合后，可有效释放载药。第三，细胞分泌的外泌体是低免疫原性的，如植物或牛奶来源的外泌体。

电穿孔是一种广泛使用的药物装载方法，但它会破坏外泌体的膜结构。与电穿孔不同的是，利用外泌体靶向肽作为桥梁，肽-药物偶联物可以在温和的条件下通过肽与外泌体之间的非共价相互作用锚定在外泌体表面，而不影响外泌体原有的生理活性。

如前一节所述，CP05是一种优秀的外泌体靶向肽，可以锚定在外泌体表面蛋白CD63。Gao等人构建了一个由寡核苷酸药物PMO、肌肉靶向肽M12和外泌体靶向肽CP05组成的三元配合物。通过CP05的靶向识别，外泌体成功装载了PMO和M12。肌肉靶向肽功能化外泌体可以准确地将寡核苷酸药物递送到肌肉组织，用于治疗杜氏肌营养不良。此外，CP05还成功应用于肿瘤免疫治疗、增生性视网膜病变、外伤性视神经病变等多种疾病的治疗。CP05还能与其他靶向肽协同作用。例如，将两种胶原结合肽(LHERHLNNN和KELNLVY)与CP05结合，促进来自脐带间充质干细胞的外泌体的工程修饰(图3A)。肽-外泌体结合物能促进组织再生，已成功用于组织损伤的治疗。
除了这些工程方法外，也有报道称肽可以通过转染或连接酶插入外泌体表面蛋白。Pham等人利用蛋白连接酶将egfr靶向肽和her2靶向肽引入外泌体表面(图3B)，可以提高装载紫杉醇的外泌体的靶向能力，达到满意的治疗效果。

4 结论

近年来，随着外泌体的广泛研究，研究人员基于不同的原理开发了多种方法从生物体液中分离和富集外泌体。在分离性能方面取得了很大的进展，包括收率、纯度、质量和效率。然而，如上所述，基于这些评价指标，每种方法都有其固有的优点和缺点。因此，选择适合外泌体下游研究目的的分离方法或方法组合是明智的。尽管取得了进展，但这一领域仍有很大的增长空间。在未来的几年里，新材料的开发、性能更好的分离方法以及将它们与在线分析仪器相结合，将有望实现更准确、更有效的外泌体分离和分析。此外，筛选外泌体靶向肽作为亲和材料，开发构建肽-外泌体复合物的新方法，将为肽识别引导的外泌体研究和应用提供有用的工具。