摘要：免疫微环境在骨缺损修复中起着至关重要的作用。为了创造促进成骨的免疫微环境，研究人员正在探索增强M2型巨噬细胞分化的方法。功能性肽已被发现可以有效改善这一过程，但它们受到效率低和降解速度快的限制体内。为了克服这些问题，设计了具有M2调节和自组装模块的肽作为构建超声响应纳米纤维水凝胶的构建块。这些纳米纤维可以在超声刺激下以时间依赖性的方式从水凝胶中释放出来，激活线粒体的糖酵解代谢和三羧酸循环，抑制活性氧的产生并增强 M2 巨噬细胞的极化。该水凝胶通过触发 M2 巨噬细胞分泌 BMP-2 和 IGF-I，加速骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 向成骨细胞的分化，展现出用于骨再生的先进治疗潜力。因此，模块化设计的仿生超短肽纳米纤维水凝胶为重建骨修复的成骨免疫微环境提供了一种新策略。

1 介绍

实现理想的骨缺损修复对于创伤、肿瘤切除、萎缩性骨不连等患者而言仍然是一项重大挑战。[1] 骨缺损的再生微环境依赖于干细胞、细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）、分泌的生物活性因子[2]，其相互作用形成骨特异性微环境[3]，随着骨免疫学的发展，越来越多的研究表明，骨再生过程并非简单的骨形成和骨吸收过程，而是多个系统密切相互作用的结果，包括骨骼系统、免疫系统等[4] 免疫细胞分泌因子来建立调节成骨细胞和破骨细胞分化的微环境[5]，在骨形成和骨吸收中起着至关重要的调节作用。巨噬细胞是先天免疫系统的重要组成部分，具有显著的灵活性，可以根据微环境中存在的分子介质转化为促炎性 M1 巨噬细胞或修复性 M2 巨噬细胞 [6]，M2型巨噬细胞最终通过释放旁分泌细胞因子如BMP2、TGF-β、IGF-I和外泌体发挥重要的抗炎调节作用，分泌细胞因子促进干细胞分化和组织再生[7]，因此，调控M2型巨噬细胞极化建立有利于损伤修复的免疫微环境已成为骨再生领域的关键挑战。

目前用于调控M2巨噬细胞极化的方法主要包括生物活性剂、免疫调节剂和趋化因子[7b-d]，尽管如此，巨噬细胞的持续调节对于骨缺损修复至关重要，但由于缺乏可以长期使用的安全有效的功能分子以及难以实现控制的局部释放，这一目标尚未实现。[4a–8 ]。因此，迫切需要寻找新的功能策略，有效调节M2型巨噬细胞极化，从而改变免疫微环境，刺激骨再生。与其他生物分子相比，超短肽具有更优越的生物功能、更高的安全性和更低的合成成本[9]。然而，天然肽可能并不总是适合作为治疗剂，因为它们具有固有的弱点，例如半衰期短、物理化学性质不稳定和水解迅速。因此，开发具有临床转化潜力的免疫调节肽，包括优异的药物形成能力、抗降解性能和生物安全性，至关重要。不超过八个的寡肽通常被称为超短肽，最近受到广泛关注。因此，我们的目标是开发一种能够调节骨缺损免疫微环境的超短肽系统，以加速成骨并促进骨损伤再生。

近年来，生物活性材料作为功能分子引起了广泛关注，并逐渐被用于生物医学用途，包括治疗免疫缺陷相关疾病、加速间充质干细胞的成骨分化、改善组织血管化、促进神经再生等[10]，本研究设计了一种具有促进M2型巨噬细胞极化及BMSC分化能力的超短肽(Ser-Glu-Ser-Ser-Glu,SESSE) (方案 1 ）以增强体内稳定性，我们模块化设计了 SESSE 肽，具有组装模块（CFF，黄色）和 M2 极化模块（SESSE，绿色），可以自组装成纳米纤维。此外，我们合成了超声响应水凝胶就地采用自组装超短肽纳米纤维（记为UPN@水凝胶）修复骨损伤引起的三维空间缺损。超声引发的水凝胶是由海藻酸盐的羧基与钙离子配位形成的[11]，超声处理破坏了钙离子与羧基之间的配位，导致水凝胶降解，从而促进了封装纳米纤维的释放[12]。同时，UPN@水凝胶作为稳定、可变形的三维支架填充骨缺损区域，通过活性超短肽纳米纤维的控制释放，增强成骨免疫微环境，促进骨修复，为临床骨缺损修复提供一种新策略。

首先，通过 CFF-SESSE 自组装制备肽纳米纤维，如图所示方案 1. 如图所示图 1

在 SEM（扫描电子显微镜）图像中观察到交联纳米纤维网络。然后，合成了海藻酸钙水凝胶就地与纳米纤维一起制成UPN@水凝胶。为了验证此类肽纳米纤维水凝胶的成功合成，提前制作了FITC标记的肽纳米纤维。如图所示图 1B 中观察到绿色荧光的均匀分布，证实了肽纳米纤维在水凝胶内的均匀分布。此外，FITR 结果（图 S1) 的吸收峰从 1495.5 cm−1移到了 1485.8 cm−1，表明海藻酸盐的羧基与钙离子发生了配位，从而验证了海藻酸钙水凝胶的形成[13].同时，肽纳米纤维在水凝胶中的负载效率和负载量分别为45.2±1.4%和10.5±0.5%（图 S2)。此外，还应用流变学分析来确认水凝胶的流变性能，结果显示储能模量 (G') 和损耗模量 (G”) 值都很高，表明坚硬的水凝胶适合用于骨缺损填充 (图 S3）并测量了不同含量肽纳米纤维水凝胶的应力-应变曲线（图 S4)，表明负载肽纳米纤维的水凝胶的抗压强度与海藻酸钙水凝胶相比较弱，也适合填充骨缺损部位。

2.2 评估 UPN@水凝胶的超声响应性

首先研究了不同超声强度下水凝胶的降解行为。此外，还观察到超声引发UPN@水凝胶的加速释放，如图所示图 1C. 终止超声刺激后，水凝胶继续持续释放肽纳米纤维。此外，将UPN@水凝胶 浸入PBS溶液（pH 6.0和7.4）中以模拟骨缺损区域的酸性微环境，超声反应仍然加速水凝胶重量的损失（图1D和E）。此外，还应用了各种超声波参数：不进行超声处理、1 W/cm2、1.75 W/cm2和 2.5 W/cm2超声处理 2 分钟。结果表明，随着超声强度的增加，水凝胶的降解速度也加快（图S5）同样，在施加超声波后观察到了更多的 UPN@水凝胶 空腔（图1F和G)。此外，含有和不含胰蛋白酶的水凝胶之间没有显著差异，表明对胰蛋白酶具有所需的稳定性（图 S6）。除了体外学习，体内水凝胶在骨缺损中的降解动力学（图 1我）或与（图 1J) 还通过全身荧光成像研究了超声，定量表明超声响应加速了水凝胶的降解（图 1（H）。

2.3 UPN 调节巨噬细胞线粒体代谢和氧化应激

首次利用免疫荧光法研究了巨噬细胞对超短肽纳米纤维的吞噬作用，结果表明，UPN在6 h时开始被巨噬细胞吞噬，随着孵育时间的延长和UPN刺激浓度的增加，UPN被巨噬细胞吞噬的现象日益明显（图 2A).然而，超短肽纳米纤维并没有被BMSCs明显吞噬（图 2B). 线粒体代谢是巨噬细胞功能转化的关键控制器，并决定其极化状态[14]。巨噬细胞代谢组学分析显示，与UPN培养的巨噬细胞与糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）密切相关，提示UPN可以激活巨噬细胞的糖酵解和三羧酸循环（图 2C–E）。TCA循环中琥珀酸的定量分析表明UPN抑制了琥珀酸代谢（图 2F). 同时，对EMP代谢中乳酸和葡萄糖-6磷酸的定量分析表明，UPN降低了乳酸的产生（图 2G) 和巨噬细胞中的葡萄糖 6 磷酸 (图 2H).透射电镜检测巨噬细胞内线粒体的形态，结果显示UPNs诱导线粒体的形态由原来的棒球状变为膨胀的椭圆形（图 2I).将UPs和UPN孵育巨噬细胞后发现，UPN组细胞线粒体肿胀比例为53%，UP组细胞线粒体肿胀比例为38%，Ctrl组细胞线粒体肿胀比例接近20%，且UPN组细胞线粒体肿胀比例较Ctrl组进一步增加（图 2J).此外，线粒体/细胞比例结果显示，UPN组与Ctrl组相比比例进一步升高(图 2K)。通过线粒体膜电位和活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)释放分析UPN对巨噬细胞线粒体结构的影响。用JC-1检测线粒体膜电位JC-1。免疫荧光结果显示UPN可使JC-1聚合物的表达量由对照组的0.02荧光强度增至UPN组的0.13(图 2LM)。ATP检测显示，UPNs促进了巨噬细胞线粒体三羧酸循环，表明巨噬细胞能量代谢被激活(图 2N). 流式细胞术分析中，巨噬细胞内总ROS用DCGH-DA标记（图 2O)，并用 MitoSox (图 2P)。结果表明，UPN 不仅能够降低巨噬细胞中总 ROS 的释放，而且还能够降低巨噬细胞线粒体中 ROS 的释放（图 2QR)。总之，UPN可以调节线粒体代谢，增强MMP活性，减少ROS释放。

据报道，M1促炎巨噬细胞和M2修复巨噬细胞会影响损伤后的组织再生。15]。Arg1、CD206和CD163是M2型巨噬细胞表达的基因。对用UPs治疗14天的小鼠骨缺损进行基因转录测序分析显示，Arg1和CD163的表达显著增加（图3A).用超短肽纳米纤维水凝胶（记为US+UPN@hydrogel）在骨缺损区域进行14天的超声处理后，M2型巨噬细胞被F4/80和CD206标记（图3B和C）。流式细胞术显示CD206标记的M2型巨噬细胞数量占巨噬细胞总数的百分比增加（图3D)，而CD86标记的M1型巨噬细胞无明显差异（图3E).免疫荧光结果显示US+UPN@hydrogel能够增加骨缺损处CD206的表达(图3F).为了揭示仿生肽纳米纤维与巨噬细胞之间的相互作用，我们将IL-4与BMDM一起孵育，以研究M2型巨噬细胞的极化体外免疫荧光显示，UPN能够进一步促进IL-4介导的M2型巨噬细胞标志物Arg1和CD206的表达（图3G–I).流式细胞术检测CD163和CD206的表达（图3J和K)，结果显示，IL-4+UPN组CD163表达率为70.6%，IL-4组为50.3%，Ctrl组约为17.2%（图3L)，IL-4+UPN组CD206表达率为61.8%，IL-4组为40.9%，Ctrl组约为18.1%（图3M).RT-qPCR结果表明UPNs显著增加了Arg1和CD206的表达(图3同样，Western印迹结果显示UPNs明显促进Arg1和CD206蛋白表达（图3P).综上所述,本研究提示UPN@水凝胶治疗后骨缺损修复过程中,M2修复巨噬细胞起主导作用,而超声触发进一步促进了M2型巨噬细胞的极化。

2.5 通过upn调控STAT6/PPAR-γ/SOCS3轴诱导m2型巨噬细胞的极化

研究团队的初步研究结果显示，小鼠骨缺损部位通过尾静脉注射UPs 14天进行治疗，通过基因本体论分析、京都基因与基因组百科全书分析和基因集富集分析发现，UPs与JAK/STAT信号通路密切相关（图 4A–C). 为证实UPN诱导M2型巨噬细胞极化的分子机制，我们用IL-4和UPN诱导M2型巨噬细胞24小时，与Ctrl组相比，其p-STAT6荧光强度显著增加（图 4D).半定量分析显示，IL-4+UPN组（13.5%）加入UPN后，p-STAT6荧光强度较IL-4组（7.8%）和Ctrl组（1.7%）明显增强（图 4E).Western blotting结果证实，在M2型巨噬细胞中加入UPN后，p-STAT6和PPAR-γ蛋白水平上升，SOCS3蛋白水平下降，提示UPN通过增强STAT6和PPAR-γ蛋白进一步促进M2型巨噬细胞极化，而UPN介导SOCS3蛋白下降，从而促进M2型巨噬细胞极化（图 4F）IL-4+UPN组p-STAT6和PPAR-γ蛋白浓度明显升高，SOCS3蛋白浓度明显降低，而UPN组与Ctrl组之间SOCS3、p-STAT6和PPAR-γ表达无明显差异。以上结果提示UPN通过STAT6/PPAR-γ/SOCS3信号轴进一步诱导M2型巨噬细胞极化（图 4F).流式细胞术结果显示，GW9662（PPAR-γ抑制剂）抑制了UPN诱导的M2型巨噬细胞标志物CD206的表达（图 4G).流式细胞术结果显示STAT6-IN-1（STAT6抑制剂）抑制UPN诱导的M2型巨噬细胞标志物CD206的表达（图 4（H）。

BMSCs 是能够修复骨损伤的种子细胞 [16] 研究表明，巨噬细胞由促炎性M1亚型向抗炎性M2亚型的转变在骨损伤修复过程中起着至关重要的作用，因为巨噬细胞分泌的细胞因子对干细胞的募集、增殖和分化有显著的影响。[17]。为了进一步验证M2巨噬细胞旁分泌生长因子是否影响BMSC的行为和命运，我们使用共培养系统来评估BMDM和BMSC之间的相互作用。UPN处理的BMDM和BMSC共培养的示意图如图所示（图 5A).碱性磷酸酶染色检测BMSCs成骨矿化情况，发现IL-4+UPN组BMSC碱性磷酸酶活性在第7天较Ctrl组明显升高（图 5B 和 C) 和 14 (图 5D和E)，茜素红染色结果显示，共培养体系中第21天IL-4+UPN组BMSCs矿化结节数量较Ctrl组增加(图 5F、G）上述结果证明，超短肽纳米纤维可以进一步诱导巨噬细胞向M2亚型极化，因此，UPN诱导M2巨噬细胞极化后，M2巨噬细胞生长因子的旁分泌作用促进了BMSCs的成骨分化。

2.7 超声响应UPN@水凝胶在体内骨缺损治疗中的作用

建立SPF级8周龄C57BL/6J小鼠骨缺损模型，采用超声触发UPN@水凝胶（图 6A). 为了直观观察愈合过程，采用micro-CT成像检查不同组骨缺损的愈合效果。术后14天，micro-CT重建图像（图 6B) 骨缺损部位，以及 X 射线图像（图 6C)，通过Micro-CT扫描定量分析骨缺损愈合区骨体积/组织体积(BV/TV)及骨小梁厚度(Tb.Th)，结果显示US+UPN@hydrogel组骨愈合效果较好(图 6D 和 E）。此外，从骨缺损部位的组织中提取蛋白质并进行蛋白质印迹分析表明，US + UPN@ 水凝胶组的成骨蛋白标志物 BMP2 和 Col1 含量最高（图 6F). H&E染色评价小鼠骨缺损的修复能力，结果显示小鼠骨缺损区域新生骨小梁逐渐被新生骨替代（图 6G).成骨基因标志物BMP2免疫荧光检测呈红色荧光，且US+UPN@hydrogel组荧光强度最强于Ctrl组（图 6H).以上结果证实了应用超声引发的超短肽纳米纤维水凝胶材料可以有效改善骨缺损的再生。

2.8 UPN@hydrogel的体内毒性研究

本研究将UP@hydrogel（记为US+UP@hydrogel）和UPN@hydrogel（记为US+UPN@hydrogel）局部植入小鼠骨缺损部位。UP@hydrogel为单体肽水凝胶，UPN@hydrogel为组装肽纳米纤维水凝胶。利用超声刺激引发水凝胶的治疗反应。治疗14天后，用H&E染色检查心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的药物毒性，结果显示这些器官没有炎症浸润或病理改变（图 7A). 在我们的研究中，我们进行了体内评估以评估 UPN@hydrogel 的安全性。仔细提取血清样本，以研究肝脏、肾脏和心脏功能以及炎症反应的潜在变化。为了全面分析 UPN@hydrogel 的安全性，我们对提取的血清样本进行了彻底的评估。我们的重点是监测 UPN@hydrogel 引入引起的肝脏、肾脏和心脏功能的任何变化。此外，我们还仔细研究了水凝胶应用引起的炎症反应。我们测试了肝功能指标，包括碱性磷酸酶 (ALP)、白蛋白 (ALB) 和总胆红素 (TBIL) (图 7B–D）。肾功能指标包括尿素（UREA）、尿酸（UA）、肌酐（CREA）（图 7E–G）。心脏功能指标包括乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）（图 7H–J)。结果显示治疗后肝/肾/心脏功能在正常范围内。我们检测的炎症因子包括IL-6、CXC10、IFN-r（图 7KM)。显微镜下观察800 μg/ml UP和UPN作用0、48、72 h时巨噬细胞的活性情况,可见细胞状态良好,说明UP和UPN无明显毒性(图 S7 AC),随后采用CCK-8法检测0~800 μg/ml UPN@hydrogel处理BMDMs和BMSCs 0、48、72 h后的活力,结果显示UPN对细胞活性没有影响(图 S7 DF）。

3 讨论

继续探索能够改变巨噬细胞极化状态、建立有利于骨再生的免疫微环境的免疫调节分子和生物材料至关重要。[19]此外，最近的研究表明，M2型巨噬细胞可以分泌细胞因子和外泌体，帮助调节骨髓间充质干细胞的成骨分化。[20]。改善促进 BMSCs 成骨分化的免疫微环境对于骨缺损的修复至关重要。ECM 蛋白在成骨细胞分化和骨再生中起着至关重要的作用[21]牙本质基质蛋白 1 (DMP1) 是一种在骨骼中高度表达的关键 ECM 蛋白，可调节骨矿化[22],在DMP1基因突变的遗传小鼠模型中，基因转录组测序分析结果显示，DMP1的缺失与骨骼中免疫信号通路的改变密切相关[23]。有趣的是，DMP1氨基酸序列富含氨基酸S或E，S:E比例接近3:2。为了促进骨质疏松模型中的BMSC分化，我们设计并合成了超短肽SESSE[24]。最近，我们的研究发现了一个重要发现，即DMP1及其衍生肽，包括SESSE，具有调节M2型巨噬细胞极化的能力（未发表数据）。然而，SESSE肽是否能有效调节免疫微环境促进骨再生仍不清楚。此外，SESSE的稳定性和寿命有限，对其临床转化结果构成挑战。这些发现凸显了进一步研究的必要性，以确定SESSE在促进骨再生方面的治疗潜力，并解决稳定性问题，以成功应用于临床。

在这项研究中，我们开发了一种新方法来增强体内采用模块化超分子自组装概念，提高超短肽 (UP) 的稳定性。具体来说，我们设计了一种名为 SESSE 的肽，它具有自组装能力，可以形成超分子组装体，即 UPN（超短肽纳米纤维）。UPN 的形成显著提高了 SESSE 肽在生物环境中的稳定性和寿命。自组装肽纳米纤维单体包含两个功能域：（1）自组装域 CFF，源自 β 淀粉样肽，可形成肽序列并提供交联位点；[24] 和（2）治疗结构域SESSE。在水性条件下，FF结构域的疏水作用和π-π堆积使肽单体自组装成纳米纤维，其中FF结构域形成疏水核心，SESSE肽结构域形成带负电荷的亲水核心[25]。在本研究中，我们的主要目标是创造一个有利的微环境，在骨损伤恢复的早期阶段促进免疫反应，从而促进骨髓间充质干细胞（BMSC）的分化。为了实现这一目标，我们提出利用超声控制的水凝胶系统在损伤的初期控制释放高浓度的生物活性寡肽。本质上，我们的研究围绕阐明短期免疫调节作用和干细胞分化特性展开。因此，本研究中使用的水凝胶不需要相当大的机械强度或长期耐久性来促进成骨。然而，这种水凝胶的生物力学性能和弹性未来的改进将在长期应用中带来良好的前景。

此类超短肽实现免疫调节的机制在之前的研究中尚未明确阐明。[10a]巨噬细胞通过代谢重编程被激活，在骨再生过程中的免疫调节中起着至关重要的作用。[4a–8 ] .线粒体作为免疫反应的协调者，调节巨噬细胞的代谢平衡，并密切影响巨噬细胞的表型[26],本研究发现，UPN@hydrogel通过激活线粒体功能，调控巨噬细胞极化进入M2表型。JC-1是由基质金属蛋白酶（MMPs）在线粒体中积累而产生的。此外，UPN刺激显著增强了线粒体膜电位标志物JC-1聚集体的信号，增加了线粒体三磷酸腺苷的释放，降低了线粒体ROS自由基的释放速率。因此，我们假设线粒体可能传递信号并以代谢物的形式提供能量来维持巨噬细胞表型。

线粒体作为信号细胞器，被认为是主要的生物能量细胞器，为细胞活动提供能量，并参与细胞特异性表型的动态调节。[27]更重要的是，线粒体代谢物在巨噬细胞极化的诱导和维持中提供信号，并作为早期检查点分子发挥重要作用[28]。本研究表明，UPN@水凝胶 诱导巨噬细胞的 TCA 循环和糖酵解代谢，其代谢产物对巨噬细胞极化至关重要。琥珀酸是 TCA 循环中的促炎代谢物，在脂多糖诱导的 M1 巨噬细胞中积累[15a],我们发现UPN@hydrogel能明显降低巨噬细胞中促炎性琥珀酸。乳酸和葡萄糖-6-磷酸是糖酵解的促炎产物[29]，UPN@水凝胶减弱了巨噬细胞能量代谢中炎症代谢物的产生。总的来说，UPN@水凝胶促进了抗炎代谢物并抑制了巨噬细胞TCA循环和糖酵解中的促炎代谢物，这可能促进M2型巨噬细胞极化。此外，我们的研究表明，UPN还表现出通过STAT6/PPAR-γ/SOCS3信号通路调节M2型巨噬细胞极化的额外能力。具体而言，白细胞介素-4 (IL-4) 激活触发转录因子STAT6，其组装成活化的转录激活因子并与特定靶基因结合，从而促进PPAR-γ异二聚化的诱导和随后的M2巨噬细胞活化。此外，STAT6抑制了SOCS3的表达，从而促进M2型巨噬细胞的极化[三十本研究结果为UPN通过STAT6/PPAR-γ/SOCS3信号通路对M2型巨噬细胞极化发挥调控作用的观点提供了有力的证据。

为了阐明 UPN 诱导的 M2 型巨噬细胞和 BMSC 之间复杂的相互作用，我们设计了一种复杂的共培养系统，该系统涉及骨髓来源的巨噬细胞 (BMDM) 和 BMSC。获得的结果明确表明，UPN 诱导的 M2 型巨噬细胞显著增强了共培养微环境中生长因子 BMP2 和 IGF-1 的分泌。这种增强反过来又显著增强了 BMSC 的成骨分化和迁移能力，从而为 UPN 诱导的 M2 型巨噬细胞在促进骨再生方面的潜在作用提供了新的见解。虽然我们之前的研究表明 SESSE 直接促进了 BMSC 成骨分化，但需要超过八周的长时间暴露。此外，超声波还用于控制 SESSE 的释放。在骨修复的早期阶段，免疫细胞起着关键作用，而 BMSC 成骨活性通常发生在三天后。此外，值得注意的是，在体外刺激浓度为 10 至 200 ng/ml 的 UPN 在 6-24 小时内表现出对 BMSC 吞噬的显著抵抗力。这一有趣的观察结果使我们推测 SESSE 水凝胶控制 BMSC 分化的主要机制是通过免疫细胞调节进行间接调节。通过影响免疫细胞群，SESSE 水凝胶可能创造了一个有利的微环境，促进 BMSC 分化和随后的骨再生。

为了评估超声触发的 UPN@hydrogel 促进骨再生的功效，我们使用 8 周大的 C57BL/6J 小鼠建立了骨缺损模型。随后，用超声触发的 UPN@hydrogel 治疗产生的骨缺损，使我们能够评估其在促进骨修复方面的治疗潜力。术后 14 天，结果显示 US + UPN@hydrogel 组骨愈合效果更佳。此外，全面的生物学分析表明，US + UPN@hydrogel 组的骨形态发生蛋白 2 (BMP2) 和 I 型胶原蛋白 (Col1) 水平最高，这与我们从体外调查。使用苏木精和伊红 (H&E) 染色的组织学检查显示，小鼠骨缺损区域内新形成的骨小梁逐渐被再生骨取代。针对成骨基因标记物 BMP2 的免疫荧光检测显示强烈的红色荧光，与对照 (Ctrl) 组相比，US + UPN@hydrogel 组显示出最强的荧光强度。这些结果共同表明，在骨缺损建模开始后第 1-3 天进行的超声治疗有效诱导巨噬细胞转化为 M2 亚型，从而显着改变骨损伤部位周围的免疫微环境，最终增强骨缺损的愈合过程。重要的是，超声波的应用也有利于自组装肽从水凝胶中释放出来，这是由于超声波加速，从而促进成骨并显著增强骨缺损的修复能力。

4 结论

我们开发了一种超声触发肽纳米纤维水凝胶，可有效促进骨再生。超短肽 SESSE 设计有用于 M2 巨噬细胞极化和自组装的模块，以改变巨噬细胞状态。释放的肽纳米纤维激活巨噬细胞线粒体中的氧化应激，进而抑制活性氧释放，同时诱导 M2 巨噬细胞加速骨髓间充质干细胞的成骨分化。总之，这项研究为基于超短肽的活性组织工程提供了一种新途径，其中可以设计基于超短肽的生物活性材料来促进组织损伤再生。

5 实验部分/方法

5.1 超短肽纳米纤维的制备
每次实验将冻干肽溶解于二甲基亚砜 (DMSO) 中，浓度为 10.0 mg/ml，制备新鲜的 CFFSESSE 肽原液，以避免预聚集。然后，将 0.5 ml 肽原液滴入 2.0 ml 去离子水溶液中，静置 5 min。混合物再振荡 12 h，得到自组装的超短肽纳米纤维。最后，用去离子水透析 2 d 去除有机溶剂。将制备好的超短肽纳米纤维冻干保存。

5.2 负载肽纳米纤维的超声响应水凝胶的制备
为了将肽纳米纤维装入水凝胶中，将 5.0 毫克制备好的肽纳米纤维与 1 毫升 2.5% (重量/体积) 海藻酸钠，然后将其加入 1.0 ml 0.1 M 氯化钙 (CaCl2)溶液，静置10分钟。用去离子水清洗负载肽纳米纤维的水凝胶。

5.3 超短肽纳米纤维的形貌
用扫描电子显微镜（Zeiss Sigma 300 VP 仪器）评估超短肽纳米纤维的形态。在 2 kV 下使用电子模式两次记录特征。

5.4 超短肽纳米纤维的性能

5.4.1紫外可见光谱
紫外-可见吸收光谱采用紫外-可见分光光度计（INESA，中国）在 25 ℃ 下测量。波长范围设定为 200~650 nm，扫描速度为中等。

5.4.2 模量
使用 HAKKE 流变仪对海藻酸钙水凝胶进行流变分析。使用振荡条件下的应变扫描实验测量水凝胶的粘弹性。扫描测试 0.1% 至 10% 的应变，以记录储能模量 (G′) 和损耗模量 (G″) 值。所有运行均使用不同的样品作为重复。使用的频率为 1 Hz，间隙宽度为 5 mm。

5.4.3 水凝胶降解和超声波响应降解
凝胶化后，在 37°C 的温度下仔细称量水凝胶（W0）。随后，将其浸入 pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中，以创建适当的生理相关环境。然后，从样品中除去外部水，并以特定间隔称量样品（WS）。所有实验均重复进行三次。对于超声响应降解实验，以间隔时间（20 kHz、45 W、3 分钟）使用超声波处理样品。在上述实验中，所有样品均在除去外部水后称重。

5.4.4 肽释放和超声响应释放
在有或没有超声照射的情况下分析水凝胶释放肽。将含有肽的水凝胶浸入5.0 ml PBS缓冲液（pH 7.4）中。在预设的时间间隔后，从混合溶液中收集1.0 ml溶液，并加入相同体积的新鲜PBS。然后使用荧光分光光度计分析肽的浓度。在超声刺激的肽释放实验中，使用超声波（20 kHz，45 W，3分钟）以特定间隔照射样品。然后，提取1.0 ml溶液并使用荧光分光光度计进行分析。

5.5 小鼠股骨缺损模型的建立

本实验经同济大学口腔医学院医学伦理委员会批准（2019-DW-040）。实验使用8周龄雄性C57BL/6J小鼠36只。小鼠饲养在无特定病原体（SPF）环境中，温度（22±1℃）和湿度（40%～60%）可控，光照/黑暗周期为12小时，提供食物和水。手术器械在术前高压灭菌，10%水合氯醛（3 ml/kg）静脉注射。小鼠麻醉后移至实验台，手术部位用3%碘酊溶液和75%酒精消毒。随后，切开小鼠股骨皮肤，钝性剥离肌肉和筋膜，暴露股骨，0.使用直径8 mm球形钻头穿透一侧骨皮质，立即将超短肽纳米纤维水凝胶局部置于骨缺损部位，再用可吸收4-0细丝缝合皮肤，构建股骨损伤修复模型。术后使用抗生素控制感染，电热床垫（38.3±0.5）℃为动物保暖，待动物完全从麻醉中苏醒后放回合适笼具。小鼠骨缺损手术后前3天在缺损部位涂抹医用耦合剂，超声治疗2 min，强度为1.75 W/cm用可吸收4-0细丝缝合皮肤，构建股骨损伤修复模型。术后使用抗生素控制感染，电热床垫（38.3±0.5）℃为动物保暖。待动物完全从麻醉中苏醒后，放回相应笼子。小鼠骨缺损手术后前3天在缺损处涂抹医用耦合剂，超声治疗2分钟，1.75 W/cm用可吸收4-0细丝缝合皮肤，构建股骨损伤修复模型。术后使用抗生素控制感染，电热床垫（38.3±0.5）℃为动物保暖。待动物完全从麻醉中苏醒后，放回相应笼子。小鼠骨缺损手术后前3天在缺损处涂抹医用耦合剂，超声治疗2分钟，1.75 W/cm小鼠骨缺损手术后，前三天在缺损部位涂抹医用耦合剂，以1.75 W/cm2 的功率进行 2 分钟的超声治疗小鼠骨缺损手术后，前三天在缺损部位涂抹医用耦合剂，以1.75 W/cm2 的功率进行 2 分钟的超声治疗2瓦/平方米（1 M/Hz）。本次实验中的小鼠被分为六组：（1）Ctrl 组：未进行任何治疗的组（表示为“对照组”）；（2）未加载水凝胶组：未负载海藻酸钙水凝胶（记为“未负载水凝胶组”）；（3）UP@水凝胶组：超短肽负载海藻酸钙水凝胶（记为“UP@水凝胶组”）；（4）美国+UP@水凝胶组：超声处理+超短肽负载海藻酸钙水凝胶（记为“US+UP@水凝胶组”）；（5）UPN@水凝胶组：超短肽纳米纤维负载海藻酸钙水凝胶（记为“UPN@水凝胶组”）；（6）美国+UPN@hydrogel 组：超声处理+超短肽纳米纤维负载海藻酸钙水凝胶（记为“US+UPN@水凝胶组”）。每组6只实验小鼠。

5.6 微型计算机断层扫描（CT）检测骨缺损修复

对照组和实验组共36只小鼠在股骨损伤后14天被安乐死。使用micro-CT系统（micro-CT50，瑞士）分析骨缺损样本。简而言之，每个样本从骨缺损处扫描80层，包括整个骨损伤区域，并在70 kV和200 mA下量化选定区域内所有骨小梁的骨密度，空间体素大小为10μm。此外，从micro-CT分析中再生以下骨密度参数：小梁体积/总体积（BV/TV）和骨小梁厚度（Tb.Th）。

5.7 生物测定

5.7.1 小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离和培养
对36只SPF级4周龄C57BL/6J小鼠实施无痛安乐死后，将小鼠浸泡在75％乙醇中10分钟。在股骨和胫骨处切开皮肤，然后无菌分离股骨，并浸泡在含有青霉素-链霉素的无菌PBS溶液中。然后，去除股骨和胫骨周围的肌肉和结缔组织，并在双抗菌PBS溶液中冲洗三次。接下来，切开股骨和胫骨的两端，暴露骨髓腔。用2 ml注射器用完全培养液冲洗样品三次。此外，骨髓腔还要冲洗数次，直至骨壁颜色变白。然后将细胞悬液通过200目尼龙网至15 ml离心管中，并在2000 rpm下离心5分钟。弃去上清液，用红细胞裂解液重悬细胞，4 ℃裂解10 min，加入等量培养基终止红细胞裂解，2000 rpm 离心5 min，计数细胞，接种于10 cm 培养皿，37 ℃、5% CO 培养2湿度饱和。

5.7.2 小鼠骨髓巨噬细胞（BMDM）的分离
从小鼠骨髓腔中提取细胞的过程与小鼠骨髓间充质干细胞的过程类似，直到红细胞裂解，然后将细胞重新悬浮在 M-CSF 培养基（40 ng/ml）（重组小鼠 M-CSF；Petroleum Technology，Rocky Mountain，NJ）中。第 2 天和第 3 天补充含有 M-CSF 的培养基，第 5 天添加新鲜的 M-CSF 培养基。这体外实验包括四组：（1）Ctrl 组：未接受任何治疗的组（表示为“对照组”）；（2）IL-4组：用IL-4诱导巨噬细胞（标记为“IL-4组”）；（3）UPN 组：用超短肽纳米纤维诱导巨噬细胞（记为“UPN组”）；（4）IL-4+UPN组：用IL-4和超短肽纳米纤维诱导巨噬细胞（表示为“IL-4+UPN组”）。

5.7.3 免疫荧光
免疫荧光染色检测巨噬细胞极化及干细胞成骨能力。六组均在骨损伤治疗后14 d处死，收集骨缺损处的股骨，用4%多聚甲醛固定，固定48 h后将收集的组织放入10%EDTA中放置4周，每2 d更换一次脱钙液。脱钙标本用PBS清洗，用30%蔗糖溶液脱水48 h后浸入Tissue-Tek® O⋅CT包埋。用低温切片机（德国Leica Microsystems）连续切割骨缺损处，每层厚度均匀为4 μm，切割后的标本室温放置30 min后，放入4 ℃丙酮中10 min。烘干30 min后，PBS洗涤3次，每次5 min。随后，用10%山羊血清在室温下封闭切片1 h，进行免疫荧光染色。将用适当比例稀释的一抗工作液（BMP2，1:200，Bioss）的PBS滴加到样品中，在4 ℃避光环境中孵育过夜。用PBS滴洗3次，每次10 min，然后加入适当稀释的二抗工作液和鼠源抗体（594，1:1000，Thermo Fisher）。在共聚焦显微镜（NIS Elements，Nikon，日本）下，使用专门的图像软件（ImageJ，NIH，美国）进行分析。切片用10%羊血清室温封闭1h后进行免疫荧光染色。将用适当比例稀释的一抗工作液(BMP2,1:200,Bioss)的PBS滴加到样品中，4℃避光孵育过夜。用PBS滴洗三次，每次10min，然后加入适当稀释的二抗工作液和鼠源抗体(594,1:1000,Thermo Fisher)。在共聚焦显微镜(NIS Elements,Nikon,Japan)下，使用专门的图像软件(ImageJ,NIH,USA)进行分析。切片用10%羊血清室温封闭1h后进行免疫荧光染色。将用适当比例稀释的一抗工作液(BMP2,1:200,Bioss)的PBS滴加到样品中，4℃避光孵育过夜。用PBS滴洗三次，每次10min，然后加入适当稀释的二抗工作液和鼠源抗体(594,1:1000,Thermo Fisher)。在共聚焦显微镜(NIS Elements,Nikon,Japan)下，使用专门的图像软件(ImageJ,NIH,USA)进行分析。PBS滴洗3次，每次10 min，加入适当稀释的二抗工作液及鼠源抗体（594，1:1000，Thermo Fisher），在共聚焦显微镜（NIS Elements，日本尼康）下，采用专门的图像软件（ImageJ，美国NIH）进行分析。PBS滴洗3次，每次10 min，加入适当稀释的二抗工作液及鼠源抗体（594，1:1000，Thermo Fisher），在共聚焦显微镜（NIS Elements，日本尼康）下，采用专门的图像软件（ImageJ，美国NIH）进行分析。

为了评估细胞迁移，将细胞在室温下用 4% 多聚甲醛固定 20 分钟，用 PBS 清洗，然后用 10% 山羊血清封闭 1 小时。用 PBS 再次清洗细胞 3 次，每次 5 分钟。将用适当比例的一抗工作溶液（Arg1，1:200，Bioss；CD206，1:200，Proteintech；p-stat6，1:100，Cell Signal）稀释的 PBS 逐滴加入样品中，并在黑暗环境中在 4 °C 下孵育过夜。在共聚焦显微镜（NIS Elements，尼康，日本）下，使用专业图像软件（ImageJ，NIH，美国）进行分析。

5.7.4 蛋白质印迹法
将预冷的裂解缓冲液加入细胞中，但在裂解前向细胞中加入 50 μl 蛋白酶抑制剂和 50 μl 磷酸酶抑制剂。接下来，将 250 μl WB Super RIPA 裂解缓冲液加入到 1 × 10 6细胞，加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物各2.5 μl。将混合物置于冰上使细胞裂解30分钟，然后在4°C以13,000 rpm离心5分钟。收集上清液，其中含有需要提取的蛋白质。使用BCA技术测定蛋白质含量，并计算所得样品的浓度。与适当缓冲液混合后，5×十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶在70°C下加热10分钟以变性。使用SDS-PAGE和PVDF膜有效地分离蛋白质提取物，所述膜用纯甲醇饱和5秒钟。用快速阻断溶液（Biotech，NO。C510053）进行蛋白质阻断，并将样品与稀释的一抗在4°C下孵育过夜。TBST（Biotech，No.使用二抗（C006161）洗PVDF膜三次，每次10 min。加入稀释后的二抗，孵育1 h。PVDF膜显影采用化学发光试剂盒（Pierce公司，美国）。一抗工作液为：BMP2，1：1000（Bioss公司，中国）；Col1，1：1000（Bioss公司，中国）；Arg1，1：1000（Bioss公司，中国）；CD206，1：1000（Proteintech公司，美国）。二抗工作液为：A32790，1：1000；A32729，1：1000（Thermo Fisher公司，中国）。Arg1，1：1000（Bioss，中国）；CD206，1：1000（Proteintech，美国）；二抗工作液为：A32790，1：1000；A32729，1：1000（Thermo Fisher，中国）。Arg1，1：1000（Bioss，中国）；CD206，1：1000（Proteintech，美国）；二抗工作液为：A32790，1：1000；A32729，1：1000（Thermo Fisher，中国）。

5.7.5 实时定量聚合酶链式反应 (RT-qPCR)
根据制造商的说明，使用 TRIzol（Takara，中国）试剂提取 RNA，并使用 HiScript II Q RT SuperMix 将 1.0 μg RNA 逆转录为 cDNA。所有数据均基于β-actin 作为基于先前研究的统一参考[27].RT-qPCR引物序列如下：

5.7.7 碱性磷酸酶活性检测
分离培养 BMSC 后，以 6×10 4 个细胞/ml的密度接种于 12 孔板中，培养 7 和 14 天。当细胞密度达到 80% 时进行碱性磷酸酶 (ALP) 染色。碱性磷酸酶显色液按照制造商的说明制备（Mlbio，上海，中国）。使用 PBS（PromoCell，英国）冲洗样品两次，每次 5 分钟。将孔中的细胞在室温下用 4% 多聚甲醛固定 30 分钟，并使用 diH2O.然后，将细胞在37°C下孵育30分钟，用diH2O并干燥。用光学显微镜（Leica，英国）在20倍放大倍数下对细胞进行拍照，碱性磷酸酶染色呈现蓝色。

5.7.8 细胞毒性测试体外
UP组和UPN组提前孵育6 h，浓度分别为6.25 ng/ml、12.5 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml和200 ng/ml，不同浓度活性肽暴露细胞的培养时间为0、48和72 h。使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测细胞增殖情况，具体操作参照厂家说明。每2 ml培养基加入100 μl CCK-8，孵育2 h。使用Gen5™酶标仪（BioTek仪器）在450 nm处对细胞进行检测（12孔板3×3点），并在显微镜下观察细胞的活性状态。

5.7.9 细胞毒性测试体内
骨缺损小鼠，US+UP@hydrogel组放置超短肽水凝胶，US+UPN@hydrogel组放置超短肽纳米纤维水凝胶，两组均进行超声处理。14天后取其心脏、肾脏、脾脏、肺脏和肝脏进行苏木精和伊红（H&E）染色，观察这些器官的细胞结构和形态，并密切观察小鼠的状态。

5.8 统计分析

数据以平均值±标准差表示。使用 SPSS 19.0 软件（SPSS，芝加哥，IL）进行统计分析。采用 Kolmogorov-Smirnov 检验来验证数据的正态分布。使用单因素方差分析 (ANOVA) 检验变量的显著性影响。使用多重比较 Tukey 检验在预设的 alpha 为 0.05 时比较数据。P 值 < 0.05 被认为具有统计学意义。

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