摘要: 目的 了解病毒入胞、内含体逃逸等机制,从中得到启发为进一步设计开发高效智能、仿病毒载药工具提供帮助。方法 纵观在长期的进化过程中病毒因宿主的杀伤压力,为生存、复制延续所形成的独特的跨膜、内含体逃逸以及亚细胞器定位等本领,揭示其给我们在仿病毒载药多肽设计开发方面的启示。结果与结论  对病毒感染机制全面、深入的了解,有助于我们利用病毒逃避宿主杀伤机制,为设计、研发高效率非病毒载药多肽提供新思路。

病毒一般是透过皮肤黏膜屏障,经由血液感染靶细胞而定居于宿主体内,完成一次感染需要经历:①与细胞表面的受体结合;②内化进入细胞;③从内含体中逃逸;④进入特定细胞器。病毒在漫长的进化过程中获得了诸如逃避杀伤、利用和控制宿主细胞为自身增殖服务的本领。笔者以人免疫缺陷型病毒(humanimmunodeficiencyvirus-1,HIV-1)和流感病毒等为例回顾病毒入胞、感染机制,对借鉴病毒感染机制,利用病毒逃逸“元件”指导设计高效载药多肽(bio-drugdeliv-eringpeptides)研究作一综述和展望。

1  病毒入胞和胞内运输机制(mechanisms of intracellular trafficking)

病毒感染首先需要和细胞膜表面蛋白、脂类及糖等分子相结合[1],其中一部分膜分子是病毒特异性受体,通过结合病毒表面分子介导入胞;另一部分膜分子则是非特异性黏附因子,起增强与病毒颗粒细胞表面的结合与浓集作用。一些病毒仅需要一种受体,例如流感病毒受体为细胞表面带有唾液酸的糖蛋白,鼻病毒Ⅱ型(human rhinovirus type2,HRV-2)受体为低密度脂蛋白等;另一些病毒由于初始受体激活的信号不足以使其入胞,需要招募和活化细胞表面相关共受体,共受体和病毒亲和力低,在初始受体与病毒结合后才会发挥增强结合能力的作用。依赖共受体协助入胞的病毒如HIV-1,其初始受体为CD4,共受体为趋化因子受体CCR5或CX-CR4;JC病毒[2]初始受体为三唾液酸神经节甘酯(GT1b),共受体5HT-2a;柯萨奇B病毒(CoxsackievirusB,CVB)初始受体为CAR,共受体为DAF。

病毒颗粒的内化主要是通过网格蛋白依赖、包膜窖介导以及直接与膜融合等方式进行。

1.2.1 网格蛋白依赖的内吞(clathrin-mediatedendocytosis)   一旦病毒与受体结合,即在细胞膜上形成配-受体聚集的有被小窝,继而内陷并脱离细胞膜形成网格蛋白包被的有被小泡,在解聚酶作用下,融合形成早期内含体,逐渐与溶酶体融合。在这一过程中,一般内含物会随pH值下降而在溶酶体中被降解。但病毒外壳蛋白则会随pH值下降发生构象改变,破坏内含体膜稳定,进而进入胞浆逃避溶酶体的降解。

胞膜窖介导的内吞机制主要发生在极性细胞中,可能与病毒有无包膜,直径大小有关。如猴病毒40(simian virus40,SV40)、新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)以及呼吸道病毒(respiratory virus,RSV)都是以胞膜窖介导机制被内吞的[3]。

1.2.3  病毒直接与胞膜融合   有包膜病毒最有效的入胞方式是在中性pH条件下直接与细胞膜融合,将其基因组DNA或RNA直接送入胞浆[4]。研究表明,HIV-1表面存在的糖蛋白gp120与靶细胞膜上的初始受体CD4结合,使病毒包膜蛋白构象发生改变,促使其招募并进一步与共受体CXCR4或CCR5结合。这种膜与膜之间的相互作用,使暴露出的糖蛋白gp41会在其中部亮氨酸拉链保守序列卷曲螺旋结构的作用下象弹簧一样弹入靶细胞膜中,拉近病毒包膜与细胞膜的距离,随之发生膜融合并将病毒RNA释放进入胞浆。

不同病毒有不同的逃逸策略,比较简单的逃逸机制是病毒与细胞膜表面受体特异性结合,直接将基因组释放入胞完成感染;比较复杂逃逸机制则是病毒与受体特异性结合后被内吞进入内含体,再突破内含体/溶酶体膜进入胞浆。

1.3.1 有包膜病毒的逃逸机制   病毒包膜融合蛋白分为I型和Ⅱ型融合蛋白,不同融合蛋白以不同机制与内含体膜发生融合。I型融合蛋白融合前后都是三聚体形式,融合后形成α-螺旋。流感病毒血凝素HA是经典的I型融合蛋白,病毒通过HA糖蛋白与唾液酸结合形成病毒-受体复合物依赖网格蛋白受体介导的内吞而内化,至晚期内含体时,低pH值诱导HA蛋白构象改变,使无融合活性的母体HA被剪切成HA1和HA2两种多肽[5]。HA2是一种融合肽,其疏水端与内含体膜发生作用,破坏内含体膜的稳定性,导致病毒包膜与内含体膜融合,将病毒基因注入胞浆。Ⅱ型融合蛋白在融合过程中经历了从二聚体到同源三聚体的转变,同源三聚体的融合蛋白能插入内含体膜,形成具有β-折叠的三聚体发夹结构,使病毒基因进入胞浆。

1.3.2 不依赖于融合蛋白的内含体逃逸机制  无包膜病毒通过膜裂解或打孔方式将病毒基因组释放至胞浆。膜裂解方式是阳性电荷沿着磷脂膜表面垂直排列,像地毯一样将整个细胞表面覆盖,进而发生倒转,产生去垢剂样作用,使膜的稳定性被破坏,出现瞬时高通透性,使其得以内化。打孔式是肽成束排列插入细胞膜中,桶样结构的孔型通道(疏水性氨基酸)与膜疏水核心相互形成外表面,亲水氨基酸形成孔的内表面,进一步发生跨膜转位,实现内化。

当病毒核心成分进入胞浆后,其基因组和相关蛋白在胞浆中的运输机制非常复杂,不同组分会在其特定信号作用下,定位于细胞内不同位置发挥其功能,如作用于DNA或其他与复制、转录有关因子需要进入细胞核;部分蛋白质需要停留在胞质内发挥作用,在胞核、胞浆、内质网以及高尔基体,通过一系列的复制、转录、合成、成熟及运转等复杂过程产生新一代的病毒颗粒。

2  病毒感染机制对载药多肽设计的启示

病毒能高效率地进入特定细胞进行基因复制,表达自身蛋白,产生新的病毒颗粒,因此一些病毒被改造成为基因治疗的有效载体。病毒载体虽经改造除去了病原性,保留了其高效基因转染特性,但因其安全性隐患、制备复杂、目的基因容量受限以及免疫原性等问题,限制其推广应用。因此人们对低毒的非病毒载体开发寄予了厚望。在众多的非病毒载体中,利用病毒入胞机制和“元件”设计开发的载药多肽(包括细胞膜穿透肽、内含体逃逸肽和亚细胞器定位肽等)更为引人注目。这类多肽可以独立,也可以联合有机高分子、脂质体等形成高效、安全的仿病毒载体,用以提高基因药物或基因工程蛋白药物靶向递送、转染(导)以及胞内运输效率

细胞膜的选择通透性阻止了绝大多数大分子物质进入胞内,限制了许多必须进入细胞内部才能发挥治疗作用的蛋白以及核苷酸等作为药物的推广应用[6]。细胞膜穿透肽(cell penetrating peptides,CPPs)是近些年来发现的,能有效将生物大分子跨膜送入细胞内的一类富含阳离子的短肽。根据其来源大致可分为两类,一类是来源于病毒或微生物的天然存在蛋白,如来源于HIV-1tat肽段的TAT、果蝇同源触角蛋白(drosophila hemeoprotein an-tennapedia transcription protein,ANTP)、I型单纯疱疹病毒(herpes simplex Virus type1,HSV-1)蛋白的VP22和乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus,HBV)的PreS2等;另一类为根据CPPs的特点人为合成的短肽如多聚精氨酸、MPG、PEP-1、MAP、transportan和各种基于不同信号序列合成的肽段等[7]。CPPs能在体外或体内作为载药多肽,介导一系列生物活性分子如蛋白质、多肽、siRNA、DNA甚至纳米颗粒等进入细胞,发挥各自的生物学效应。这类CPPs基本无毒副作用,并不干扰所携带生物大分子活性[8]。迄今发现的CPPs大部分是直接来源于病毒蛋白或由病毒相关“元件”组合而成的。

2.1.1  TAT  TAT(YGRKKRRQRRR)是HIV-1反式转录因子tat的第48~60位氨基酸残基片段。Guelen等[9]的研究发现TAT-VP3能有效诱导成骨肉瘤细胞Saos-2和人类口腔癌鳞状细胞HSC-3凋亡。Liu等[10]将TAT偶合于聚乙二醇-胆固醇载体材料上,形成双功能靶向载体TAT-PEG-b-Chol,发现相对于PEG-b-Chol,TAT-PEG-b-Chol能更有效地携带纳米颗粒穿过血-脑屏障并定位于神经细胞的胞核。Tian等[11]将TAT与dsRNA结合域(DRBD)形成融合肽后能有效地将siRNA运送至胞浆。Eguchi等[12]的研究结果表明,用TAT-DRBD不仅可以有效将siRNA送入各种培养细胞株,也能将siRNA送入原代培养细胞、干细胞甚至能在个体水平成功递送有生物活性的siRNA。TAT可以使得原本不能进入细胞的大分子蛋白、siRNA等高效进入细胞。

2.1.2  MPG  MPG是由来源于HIV-1糖蛋白gp41的N端胞膜融合序列和来源于SV40的核定位信号的一段亲水系列通过3个氨基酸间隔连接而成的27个氨基酸残基的CPP。Simeoni等[13]研究发现,MPG可以携带寡聚核苷酸,质粒DNA,siRNA等进入培养的哺乳动物细胞,MPG能介导对贴壁、悬浮细胞,癌细胞株或原代细胞的高效率转染,这是其他非病毒转染方法不能达到的。Veldhoen等[14]通过改变疏水端6个氨基酸来修饰MPG制备了MPGα,发现能与核酸形成非共价连接的、高度灵活性的复合物,高效地介导了siRNA转染,有效地下调了培养细胞的目的基因表达。

此外研究者们还尝试了利用很多病毒“元件”如狂犬病毒胞膜蛋白[16]、肮病毒蛋白[17]等向肿瘤细胞或神经细胞递送药物。

研究发现,CPPs及其携带生物分子会被局限在内含体等胞内囊泡中而影响CPPs介导的递送效率,CPPs及其携带分子能否从内含体中逃逸是胞内运输的限速步骤。研究人员在应用促渗剂、优化跨膜输送条件[18]的同时也从病毒的内含体逃逸过程中得到启发。病毒的逃逸机制可能与其利用自身具有逃逸功能的某些结构“元件”在低pH值环境中破坏内含体膜有关。

2.2.1  流感病毒红细胞血凝素HA2  Michiue等[19]连接流感病毒HA2、多聚精氨酸(9R)和P53形成融合蛋白,作用于恶性胶质瘤细胞发现,HA2-P53-9R融合蛋白能更好地抑制肿瘤细胞生长,诱发凋亡。wadia等[20]将TAT与HA2构成融合多肽,通过观察TAT-HA2介导转导重组酶Cre的酶活性发现,HA2能显著增强融合蛋白从内含体中释放,使胞内Cre活性显著提高。Sugita等[21]用荧光素标记的TAT和/或TAT-HA2作用于细胞后发现,TAT单独处理细胞时荧光主要集中在内含体内,而经TAT-HA2共处理后在胞浆观察到大面积均匀分布的荧光。

2.2.2 人乳头瘤病毒(HPV)衣壳蛋白L2    Kamper等[22]发现,野生型L2包被的病毒基因组能从细胞内含体中逃逸转移到核内,而野生型L1单独包被的基因组及L2羧基端缺失突变体包被的基因组则不能穿透内含体膜进入胞浆到达胞核。提示HPV衣壳蛋白L2羧基端的23个氨基酸残基具有内含体逃逸功能。将CPPs与L2羧基端短肽融合有可能促进CPPs及其携带分子从内含体逃逸,提高其生物学活性。

2.2.3  含组氨酸的病毒多肽    分子病毒学研究发现,很多病毒的内含体逃逸与其膜蛋白中的组氨酸有关,在酸性环境中,组氨酸的存在和暴露会发生质子化,从而影响内含体膜稳定性使病毒成分逃逸进入胞浆。具有内含体逃逸功能的细胞膜穿透肽EB1就是依据这种理论设计的,以易形成α-螺旋的组氨酸取代了penetratin序列上特定的氨基酸,从而促使其从内含体中逃逸。Lundberq等[23]研究发现,EB1可以高效地介导siRNA下调靶基因表达。Lo等[24]通过在TAT上偶联组氨酸和半胱氨酸发现可以促进其内含体逃逸,提高DNA转染效率。

由于CPPs介导的各种生物大分子在细胞内发挥相应作用的位置各不相同,一些生物活性分子需在特定细胞器内才能发挥其功能。因此CPPs及其携带分子胞吞释放后的亚细胞器定位亦是其可否发挥效应的关键。前述的MPG,PEP-1在设计上都利用了病毒的核定位信号等“元件”。

2.3.1  靶向细胞核   MPG具有核定位信号(NLS)能够有效地将携带DNA等递送至胞核。MPG△NLS是在MPG基础上将NLS号中赖氨酸突变为丝氨酸而失去核定位功能的CPP。报道称[25]50nmol.L—1的MPG△NLS非共价连接siRNA复合物可以下调90%~95%荧光素酶活性(Luci-siRNA)及80%内源性GAPDH(GAPDH-siRNA)表达。

2.3.2  靶向线粒体    Zhao等[26]研究发现了一种选择性定位于线粒体内膜且具有很好的膜穿透功能抗氧化短肽SS-31。在培养细胞内加入SS-31能减少细胞线粒体内ROS的产生,并很好地对抗了叔丁基过氧化氢诱导的细胞凋亡。Sun等[27]发现了一种8个精氨酸(R8)肽的衍生物CALN-NR8肽,它可以靶向细胞核或内质网。也有报道称基于线粒体靶向的寡聚胍盐所设计的穿膜载体成功地将大分子药物递送至肿瘤细胞线粒体中[28]。

3  展望

尽管病毒载体是迄今最有效的生物大分子递送载体,其安全性等问题严重限制了其在临床上的推广应用。病毒入胞、内含体逃逸等机制为生物大分子的高效胞内输送提供了很好的思路。研究人员从病毒感染机制得到的启发已经在载药多肽设计中得以运用,利用这种思路设计的CPPs得以逃逸内含体,精确地靶向亚细胞器等,使CPPs能更高效、准确地向靶细胞内运送各种生物活性分子,以达到治疗及预防疾病的目的。我们在探究优化CPPs穿膜效率的同时,也尝试了运用靶向CPP携带抗癌蛋白诱导肿瘤细胞凋亡[18,29]。随着分子病毒学的研究不断深入,人们对病毒将会有更深的理解,将来的高效智能、仿病毒载药工具设计将会自如地避免病毒有害成分,运用其有益“元件”,使基因工程蛋白、siRNA、DNA等新一代治疗药物得以推广应用。

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