摘要   树枝状化合物是一类具有规整结构和单分散性的大分子化合物,具有不同于普通高分子化合物的独特理化性质,广泛地应用在材料、催化以及生物医学领域中.简要综述了树枝状化合物作为药物载体及其在抗病毒、抗肿瘤以及多肽和糖模拟物等领域的研究进展.

树枝状化合物是一类具有高度分支结构和良好单分散性的大分子化合物,其分子的体积、形状和功能都可以精确控制[1].树枝状化合物的合成研究开始于1978年Vögtle的工作[2],但较受关注和研究的是随后几年Tomalia[3]提出的PAMAM型树枝状化合物和Newkome[4]发展起来的“arborolsystem”.其共同特点是采用“发散法”合成.Fréchet[5]首先在树枝状化合物的合成中应用了“收敛法”,这两种方法是合成树枝状化合物中最常用的方法.近年来,树枝状化合物的研究主要集中在将功能化的组分连接到树枝状化合物的骨架上,以期获得具有独特性质的新化合物,在液晶材料[6]、主客体化学[7]、生物分子模拟物[8]、催化剂[9]、药物与基因载体、免疫诊断试剂[10]等方面有广阔的应用前景.

1  作为载体的树枝状化合物

树枝状化合物的高度分支结构和单分散性为发展一类更为有效的药物载体提供了可能.普通的高分子药物载体通常有两种形式:一种是将药物连接在高分子载体外周,通过物理或化学方法使药物分子从载体上脱落下来;另一种方法是用高分子载体将药物包裹起来,通过化学或物理方法破坏载体从而使药物释放出来.树枝状化合物作为药物载体的优势在于分子的单分散性使其药代动力学性质稳定、可重现;并且由于其末端基团的可变性,通过改变分子末端基团的种类和数量就可以调节分子的溶解性和载药量;与药物通过共价键连接也保证了药物通常不会因物理因素(如pH值的改变)而从载体上脱落下来[11]

理想的树枝状药物载体应当是无毒、无免疫原性、可体内降解、并具有良好的体内分布性和组织靶向性[12].Malik 等[13]对几类常见的树枝状化合物的淋巴毒性和体外细胞毒性进行了研究, 包括 PAMAM(聚酰胺胺)、DAB(以1,4-丁二胺为核心的聚丙烯亚胺)、DAE(以乙二胺为核心的聚丙烯亚胺)、CSi-PEO(碳硅烷-聚乙二醇)型树枝状化合物, 结果显示阳离子型树枝状化合物具有一定的细胞毒性, 而其对淋巴的影响与其结构相关.PAMAM型树枝状化合物的毒性较小, 但对淋巴的影响随代数上升而增大. 令人感兴趣的是, CSi-PEO 型树枝状化合物的淋巴毒性比PAMAM 型树枝状化合物的毒性还要小. 使用125I标记的PAMAM型树枝状化合物研究了其在Wistar大鼠体内的分布, 结果显示阳离子型树枝状化合物很快就被清除, 而阴离子型树枝状化合物的血浆清除速率较慢, 研究同时显示随着树枝状化合物代数的增加血浆清除速率也随之上升.

1988年Tam等[14]首先提出了以聚赖氨酸为骨架的树枝状化合物, 由于使用了天然氨基酸为骨架, 其生物相容性较好. 此后以谷氨酸[15]、脯氨酸[16]、丙氨酸[17]等氨基酸为骨架的树枝状化合物也陆续被合成出来.

2   树枝状化合物作为药物载体的应用

2.1   树枝状化合物作为抗病毒药物的载体

第一类用于抗病毒研究的是树枝状聚阴离子化合物[18], 研究表明, 聚阴离子型树枝状化合物和传统的高分子聚阴离子化合物均显示一定的抗病毒活性[19]. 由于高分子聚阴离子化合物难以通过合成途径得到均一分子量的产物, 因此研究这样一种由不同分子量的高分子化合物组成的混合物的构效关系是相当困难的. 而树枝 状聚阴离子化合物具有单分散性, 由于其分子结构精确、规整, 研究其结构与活性的相关关系也相对容易. 根据 这种思想,Withrouw等[20]合成了以PAMAM为载体的树 枝状聚阴离子化合物(图1), 其抗HIV病毒活性优于右旋 糖酐硫酸盐, 进一步的药理与构效关系研究表明: (1)在 已经合成的树枝状聚阴离子化合物中, 随着树枝状化合 物分子量和代数的增加, 其对HIV 病毒的抑制作用增 强; (2)在位于分子表面的阴离子基团中, 萘二磺酸表现 出了最强的活性; (3)使用酰胺键连接的树枝状化合物稳 定性较高.

基于以上构效关系, Matthews 等[21]合成了 1-(羧甲氧基)-萘-3,6-二磺酸作为表面基团, 以PAMAM、聚赖氨酸和PPI型树枝状化合物为载体的化合物, 生物活性实验表明其抗HIV活性IC50均在1μg/mL左右. 虽然不同载体的化合物表现出了相似的生物学活性, 但由于PPI在合成中使用了钴盐, 而PAMAM在合成中使用的Micheal 加成反应在合成高代树枝状化合物时可能产生有瑕疵的化合物, 因此最终选择了生物相容性较好的以聚赖氨酸为核心的化合物 SPL7013(图2), 进一步的研究表明, SPL7013 与Vivagel合用对SHIV 的预防率为100%(图3)[22],  目前, 该化合物已经在FDA注册, 正在进行临床前实验.

2.2   树枝状化合物作为抗菌药物的载体

具有抗菌活性的树枝状化合物表面通常带有带正电荷的氨基或季铵盐(图4)[23]. 该类化合物的作用模式通常是粘附并破坏细菌带负电荷的细胞膜并导致细菌死亡. 表面用季铵盐修饰的PPI型树枝状化合物对革氏阳性和阴性菌都有很强的抑制作用[23]. 表面用甘露糖修饰的聚赖氨酸树枝状化合物能抑制大肠杆菌粘附到马血红细胞的过程, 有进一步开发成为新型抗菌药物的潜力[24].

2.3   树枝状化合物作为抗肿瘤药物的载体

最初将树枝状化合物作为肿瘤靶向载体的研究表明,PAMAM型树枝状化合物与铂离子的络合物可以选择性提高皮下肿瘤组织中的铂离子浓度.1999年Fréchet等[25]合成了以醚键延伸的含叶酸和甲氨喋呤的(MTX)的肿瘤靶向性树枝状化合物.将树枝状化合物的肼基与叶酸或甲氨喋呤的γ-羧基结合,化合物对叶酸受体的亲和性良好,并且在生理pH条件下的磷酸盐缓冲溶液中有良好的溶解度.Thomas等[26]合成了以PAMAM为核心的含叶酸、甲氨喋呤和荧光素的树枝状化合物(图5),并测定了其体外生物活性.结果表明化合物对高叶酸受体表达的细胞有明显的亲合作用.Zhou等[27]合成了含5-氟尿嘧啶和PAMAM型树枝状化合物结合的化合物(图6),并研究了其体外释放曲线.5-氟尿嘧啶具有较强的抗肿瘤活性,但是其对细胞的毒性也较大,限制了它在肿瘤治疗中的应用.将第四代和第五代树枝状化合物与5-氟尿嘧啶结合后,发挥了缓释作用,但化合物的毒性和树枝状化合物载体的作用机制尚待研究.Sun等[28]合成了将树枝状化合物与氮芥结合的化合物,并计划将该化合物与单克隆抗体ScFvs结合,利用单克隆抗体的靶向性和氮芥的细胞毒作用实现对肿瘤的选择性杀伤.

树枝状化合物在肿瘤治疗中的另一个重要应用是硼中子捕获治疗. 硼中子捕获治疗的基本原理是基于稳定同位素10B与热中子的核反应, 可产生4He和7Li＋, 由于裂变产生的高能离子在组织中的运动范围与单个细胞的大小大致相当, 因此将 10B 定位于某个细胞, 就可以实现对该细胞的选择性杀伤. 最早在 1994 年就有报道[29]将十硼烷(B10H14)与全碳氢胶束树枝状化合物连接,硼烷位于分子内部, 分子表面为磺酸基, 整个分子具有良好的水溶性.

研究发现大多数高级神经胶质瘤表现出表皮生长受体表达增加, 因此Qualmann 等[30]将十硼烷与树枝状化合物连接, 再将该树枝状化合物与表皮生长因子(EGF)结合(图7), 体外试验表明该化合物先结合到细胞表面, 再被细胞摄入并导入溶酶体中.

杜宇国等[31] 合成了含寡聚氨基葡萄糖的树枝状化 合物(图 8),  并进行了体外抗肿瘤活性测试,  结果显示树 枝状寡糖化合物具有一定的抗肿瘤活性.

2.4   树枝状化合物作为生物活性多肽的载体

许多多肽化合物具有生物活性和治疗作用, 它们在体内许多组织器官和生理过程中发挥重要作用. 如: 中枢神经系统、消化系统、哮喘、过敏、离子转运等. 多肽化合物的另一个特点是能被特定细胞摄取, 从而在药物转运上有潜在的应用前景[32]. 但是由于体内蛋白酶的作用, 其体内稳定性较差, 这就大大限制了其作为药物的应用. 由于树枝状化合物具有类似于蛋白质的三维球状结构, 因此将多肽与树枝状载体连结得到的树枝状多肽化合物具有以下特点: (1)分子具有类似蛋白质的球状结构, 使其能作为受体模拟物与一些配体结合; (2)分子具有多共价结构, 使其能同时与两个或多个分子相互作用, 增强了生物活性; (3)由于多肽是内源性物质, 整个分子的潜在毒性较小; (4)分子具有较好的水溶性, 这对于改善大分子化合物的药代动力学性质有重要作用; (5)由于树枝状多肽的分子表面分布有多个肽链, 降低了其水解速率, 增强了其体内稳定性.

在树枝状多肽领域,   目前受关注和研究最多的是 1988  年 Tam[33]首先提出的多抗原多肽(multiple  antigen peptide, MAP).  传统的抗原多肽出于诱导免疫反应的目 的,  需要接在一个比较大的多肽或蛋白质之上.  但这种 免疫原抗原决定簇密度低,  而且载体蛋白可能会诱导其 他免疫反应,  而树状免疫原可以很好地克服这个缺点.树状核心上可以同时连接很多小肽,  在单位质量上有更 多的抗原决定簇,  因而具有更高的抗原性,  同时兼备了 易于合成、能可靠地诱导位点特异的抗体并可以诱导多 样的免疫反应等优点[34](图 9).

1989年Tam等[35]合成了具有多抗原决定簇的多抗原多肽, 该分子同时具有代表HBV病毒中S和S(2)片段的独立抗原决定簇, 加强了分子的免疫原性. 1990 年他们又合成了具有连续T细胞和B细胞抗原决定簇的MAP, 用于疟疾疫苗[36]. 随后 Tam 等[37]又合成了具有HIV-1表面抗原gp2120和亲脂性的三棕榈酰甘油半胱氨酸酯基团的AIDS疫苗(图10).

除此之外, Oliveira 等[38]合成了具有聚赖氨酸核心的多抗原多肽作为口蹄疫疫苗. Baigude 等[39]合成了具有多糖外层的多抗原多肽, 用作AIDS疫苗. 现在, 多抗原多肽已经被常规应用在制造抗体和细胞毒性免疫反应研究方面. 对比研究显示多抗原多肽比通常多肽-蛋白质聚合物具有更高的效能和更快的诱导抗体速度.Sadler等[40]的综述详细地总结了树状多肽的该用途.

在很多自身免疫疾病的模型系统中, 树枝状多肽被证明可以作为蛋白质的替代物. 具有不同周围多肽的树状多肽被用来在健康动物体内模拟系统性红斑狼疮[41].Goodman等[42]用树状多肽模拟了含162个氨基酸残基,具有超螺旋结构的胶元蛋白类似物(图11). Raju等[43]合成了分子内含有TKPPR序列和荧光指示剂的树枝状化合物. 本课题组[44～46]也合成了一系列含RGD序列多肽的树枝状化合物(图12), 正在研究树枝状结构对含RGD序列多肽构象和功能的影响.

2.5   树枝状化合物作为糖类药物的载体

糖类化合物在许多生理过程中都发挥了重要作用,含糖或类糖结构的药物已经广泛的应用于抗菌、抗病毒、抗炎或抗肿瘤药物等领域. 然而, 人工合成有生物活性的的多糖化合物在技术上存在较大困难; 克服这些困难的途径之一是在树枝状化合物表面缀合单糖或寡糖, 研究表明这种表面糖修饰的树枝状化合物的生物活性可能增强300～400倍[47].Woller等[48]研究了不同代数的PAMAM 型树枝状化合物表面修饰甘露糖后的生物活性, 与单糖相比, 缀合8个和16个单糖的树枝状化合物的活性并没有明显增加, 但是缀合了 32 个单糖的树枝状化合物却显示了很强的生物活性.

Baek等[49]合成了含有肿瘤相关T抗原多糖的树枝状化合物(图13), 研究发现含有4个多糖的化合物在浓度为10－8 mol•L－1时与单体在10－6 mol•L－1浓度下的生物活性相当, 而含有6个多糖的树枝状化合物活性增加较低, 这表明空间位阻对树枝状化合物的生物活性有重要影响. 类似的多糖也被缀合到PAMAM型树枝状化合物上, 生物活性研究发现这些树枝状多糖化合物都比相应分子量的糖-高分子缀合物生物活性强[50].

2.6   树枝状化合物作为其他药物的载体

1997年,陈应春等[51]合成了醚键延伸的高密度雌激素树枝状化合物.Potluri等[52]合成了以酯键延伸的含萘普生的树枝状化合物.Groot等[53]合成了含紫杉醇衍生物的树枝状化合物(图14),其分子内含有光敏基团,其树枝状核心能在特定波长的光照下特异性断裂.Pa-leos等[54,55]合成了一类PG-PEG(聚甘醇-聚乙二醇)结构的树枝状化合物偶联叶酸作为抗癌药物他莫昔芬的载体,这类化合物具有较低的毒性,较好的肿瘤靶向性和水溶性.

3   结论与展望

树枝状化合物是一类全新的药物载体, 与传统的高分子载体相比, 它具有特殊的空间结构, 可调控分子形状和溶解性质. 其分子构象还可以通过有机大分子和无机小分子的主客体相互作用加以控制. 随着新的合成方法、分子结构的不断发现, 以及负载于树枝状化合物上的生物活性物质的种类不断增加, 作为药物载体的树枝状化合物具有广阔的发展前景.

目前对树枝状化合物作为药物载体的研究大多停留在合成和体外活性实验阶段, 其毒性、体内代谢以及树枝状载体与药物分子的相互作用等方面的研究还很少. 但有理由相信, 随着研究的进一步深入, 树枝状药物载体必将体现出其独特的优越性, 在新型药物载体的研究中占据一席之地.

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