摘要：多肽修饰的pH敏感脂质体作为药物或核酸的载体可以主动靶向肿瘤部位，使抗肿瘤药物或核酸在特定区域释放，降低药物对正常组织或细胞的毒副作用、提高药物／核酸的治疗效果。笔者主要从多肽修饰的pH敏感脂质体的释药机制、修饰方式和应用等方面进行综述，为多肽修饰的pH敏感脂质体的制备及抗肿瘤药物载体设计方面的研究提供相应参考。

脂质体最初由Bangham等[1] 观察磷脂在水中的分散性状时发现，由于其疏水亲水作用，磷脂疏水端向内部聚集，而亲水端的氢键和水相键合暴露在外，形成具有双分子层结构的闭合囊泡。脂质体具有较好的生物相容性，无毒、无溶血性、无免疫原性，可生物降解，因此成为目前最常用的载体并在药物传输方面发挥了重要的作用[2]。脂质体表面易被修饰，可以包载各类药物分子或核酸分子[3-4]。传统脂质体的磷脂成分与细胞膜成分高度相似，具有被动靶向性，易集中于机体的网状内皮系统，缺乏特定的组织靶向性，导致相应的治疗性核酸和疏水性药物的利用率较低。近几年，国内外研究者陆续制备出pH敏感脂质体[5]、热敏感脂质体[6]、超声波敏感脂质体[7]和光敏感脂质体[8]等各种功能性脂质体用于药物／核酸的高效传递。

肿瘤细胞具有旺盛的糖酵解能力，缺氧及有氧条件下都能产生大量的代谢产物乳酸，加上质子泵(H+-ATPase)及来自磷酸戊糖途径的CO2作用，导致肿瘤组织局部微环境pH值(5.8~7.0)低于正常组织(7.4)[9]。利用肿瘤组织局部微环境的这种特性，pH敏感脂质体在微酸环境下产生一定的结构  变化，从而作用于肿瘤组织并释放药物。其中，多肽修饰的  pH敏感脂质体，可利用各种功能性多肽的酸敏感、靶向及穿  膜作用[10-11] ,增强脂质体的pH敏感性、提高pH敏感脂质体  对肿瘤组织的靶向结合能力，形成多响应性或多功能性脂质  体，介导脂质体在肿瘤环境下释放药物，显著提高药物的生物  利用率并降低其毒副作用。因此，近年来多肽修饰的pH敏感  脂质体成为药物传递系统的研究热点。笔者主要从多肽修饰 的pH敏感脂质体的释药机制、修饰方式和应用等方面进行综 述，以期对pH敏感脂质体药物／核酸传递系统的研究提供参考。

1  多肽修饰的pH敏感脂质体的组成及释药机制

笔者综述的脂质体pH敏感性主要有3种形式体现：①制备基础脂质体的材料，例如具有pH敏感性的磷脂或胆固醇；②pH敏感性多肽；③其他具有pH敏感性的键或材料。

早期制备pH敏感脂质体的材料主要由两亲性的二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE)和阴离子脂类，如胆固醇琥珀酸单酯(cholesterylhemisuccinate,CHEMS)及油酸等材料通过调节其比例合成[12]。在生理pH值(7.4)条件下，DOPE和CHEMS可以形成稳定的脂质体双分子层。在肿瘤组织微环境pH值(5.8~7.0)或者溶酶体pH值(4.5~5.0)的条件下，质子化的DOPE和CHEMS导致脂质双分子层的结构由紧密转变成疏松，内部的药物或核酸得到释放[13]。类似的，一些含有脂-聚合物的复合结构，同样可以制备出pH敏感性脂质体[14]。早期的这些脂质体靶向性较差，脂质体进入机体后，容易被非特定细胞内吞，在溶酶体的酸性环境下释放抗癌药物，损害正常细胞或组织。

近年来，由于多肽分子的生物多样性，越来越多具备特 定功能的多肽被不断发现和研究，例如结构较为简单的多聚 组氨酸(poly-histidine)[15] 和多聚赖氨酸(poly-lysine)[16] ,以 及源自流感病毒的INF7肽(GLFEAIEGFIENGWEGMIDGW- YGC)[17]都具有较强的pH敏感性。其他研究较多的功能性 多肽包括温度敏感性多肽[18]、多聚阳离子／细胞穿膜肽[19]、肿瘤靶向肽[20-21]等。多肽具有一个显著的结构性优势，即可 以在不影响原有功能性多肽片段的基础上，通过固相合成或 生物合成，在多肽的一端或两端引入新的功能性多肽序列，获得多功能性融合肽[22]。结合这些不同功能性的多肽，多 肽修饰的脂质体不仅具有pH敏感性，还可以具备多功能性，例如利用受体／配体结合方式来靶向肿瘤细胞。这种具有受 体／配体结合能力的pH敏感脂质体进入细胞的机制，往往不 同于普通脂质体的融合方式。如类似RGD/αVβ3[23] 或者 Transferrin/TfR[24] 的结合方式，会诱导肿瘤组织细胞主动内 吞脂质体继而释放药物／核酸，此类多肽修饰的pH敏感脂质 体药物／核酸释放过程，见图1。

2    多肽修饰pH敏感脂质体的修饰方式

磷脂和胆固醇是合成脂质体的主要材料，研究者通过多 肽对磷脂和胆固醇的修饰制备出多种多肽修饰的 pH 敏感脂 质体。此外，直接将小分子多肽片段嵌入到脂质体内，制备 多肽嵌入型 pH 敏感脂质体的研究也有报道。

2. 1    多肽修饰磷脂类
多肽主要通过多种化学键合的方式修饰磷脂[25]。例如Zhao等[26]将pH敏感肽[H7K(R2 )2]通过酰胺键和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethano-lamine,DSPE)连接，采用薄膜分散法制备出包载多柔比星的pH敏感脂质体。同年，Xia等[27] 采用加成反应将DSPE-PEG2000-Mal和具有pH响应性的细胞穿膜肽TH肽[AGYLL-GHINLHHLAHL(Aib)HHIL-Cys]连接，合成了DSPE-PEG2000-TH,然后将大豆磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000-OMe和DSPE-PEG2000-TH按照摩尔比59∶33∶2∶6制备出多肽修饰的pH敏感脂质体。多肽修饰磷脂的主要键合方式见图2。

2. 2    多肽修饰胆固醇类
胆固醇具有调节磷脂双分子层流动性的作用。具有pH敏感性的CHEMS是一种可被质子化的胆固醇，在酸性条件下，质子化的CHEMS由于静电斥力作用，造成脂质双分子层结构的破坏[28]。研究者将功能性多肽片段和CHEMS通过酰胺键连接，制备出各种多肽修饰的pH敏感脂质体。如Chang等[23] 将靶向整合素αvβ3的小分子肽RGD和CHEMS通过酰胺键相连，RGD修饰的pH敏感脂质体能有效靶向αvβ3过表达的癌细胞，增强多西他赛的药用效果。其RGD修饰CHEMS的方式及pH敏感脂质体的释药过程见图3。

GALA(WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA)是一种pH敏感的膜融合肽，其肽链在生理pH条件下以无规卷曲为主，而在酸性条件下，富含谷氨酸的肽链质子化，GALA的结构则以α螺旋为主[29]。Kakudo等[30]将GALA和氯甲酸胆固醇酯通过酯键连接，制备出GALA肽修饰胆固醇的pH敏感脂质体。

2. 3    多肽嵌入型
类似于 GALA , 许多 pH 敏感多肽在酸性条件下，会导致 肽链二级结构的变化，如果将此类多肽嵌入到磷脂双分子 层，制备得到的 pH 敏感脂质体会随着 pH 值环境的变化改 变其双分子层的稳定性，从而释放抗肿瘤药物或核酸。

例如，Sosunov 等[31] 及 Yao 等[32] 研究者采用 pH 敏感多 肽  pHLIP ( ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADE GT)嵌入的方式制备了 pH 敏感脂质体。Reja 等[33]  设计了 一系列多肽，它们的疏水氨基酸和极性氨基酸间隔排列，在 二级结构上能形成 pH 敏感的异源二聚体，生理条件下呈现 螺旋结构，脂质体的磷脂双分子层稳定，但是在 pH 5. 5 的环 境中，多肽质子化，其结构由螺旋结构转变成松散的无规卷 曲，异源二聚体解聚，从而使 pH 敏感脂质体内的药物得以释 放。其中，P3 ( LKKIKDKLEKIKSKLYKIKNELAKIKKL) 与 P5 (LKKIKDKLEKZKSKLYKIKNELAKIKKL) 形成的异源二聚体 pH 敏感性最为突出。
由于这类多肽需要整体嵌入到脂质体的疏水层，因此多肽序列中一般含有较多的疏水性氨基酸，例如亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、色氨酸(W)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)等。过多的疏水性氨基酸给脂质体的制备带来一定的困难，因此在多肽嵌入型pH敏感脂质体中，使用两亲性杂合肽的方式最为常见。例如，Wang等[34]通过嵌入的方式将辛胺接枝的聚天冬氨酸(PASP-g-C8)插入到脂质体中，见图4。疏水性C8可以将聚合物“锚定”在脂质体疏水区，聚天冬氨酸的游离羧酸基团则可以在酸性条件下发生质子化而介导构象的变化，从而使药物得到快速释放。Hama等[35] 将接枝十八烷酸的pH敏感多肽SAPSP(stearyl-GGGGHGAHEHAGHEHAAGEHHA-HE-NH2)嵌入到脂质体内，提高了脂质体对肿瘤微环境的靶向性。Jiang等[36] 制备的脂质体嵌入了十八烷酸接枝的R6H4(stearyl-R6H4),R6H4兼具pH敏感性(H4)及细胞穿膜(R6)的功能，形成了一种多功能性pH敏感脂质体。

有意思的是，Su等[37]设计了2条具有pH敏感性，同时又富含正电荷的多肽序列(AWWKKKGGNNN、AWWRRRG-GNNN),由于具有疏水性AWW,多肽可以“锚定”到脂质体的疏水区，同时富含正电荷的赖氨酸／精氨酸片段又可以与表面带负电荷的脂质体通过静电作用而形成脂质体的“外衣”，这既是一种多肽嵌入型，同时也是一种多肽修饰磷脂型的pH敏感脂质体。

3  多肽修饰的pH 敏感脂质体作为载体的主要应用    

3. 1  多肽修饰 pH 敏感脂质体作为疏水性药物的载体
为了解决疏水性抗肿瘤药的生物利用度低和靶向性差 等问题，通常使用物理包埋的方法将药物包装到脂质体内。脂质体的磷脂双分子层具有包装疏水性药物的天然优势。肿瘤组织微环境是弱酸性环境，pH约为5.8~7.0[9]。因此，pH敏感脂质体成为一种重要的抗肿瘤药物载体，受到越来 越多学者的关注。
Ding等[38]  利用酸敏感腙键设计了一种穿膜肽(GGRRRRRRRRR)修饰的pH敏感脂质体。结果发现，pH敏感脂质体携载的DiR荧光探针在小鼠的肿瘤部位所发出的荧光信号明显高于其他载体的信号，体内药物分布实验进一步证实，穿膜肽修饰的pH敏感脂质体降低了药物在其他组织器官的分布。Zhao等[26] 利用具有多臂结构的pH敏感肽[H7K(R2)2]修饰磷脂形成pH敏感脂质体包载多柔比星。体外实验结果证实，在pH5.5时脂质体的释药量达到85%,远远大于pH7.4时20%的释药量，显示出较强的pH敏感性。体内药物分布实验也证实，这种pH敏感脂质体增加了药物在肿瘤部位的释放，对小鼠胶质瘤组织具有更强的抑制作用。

Shi等[39]利用环形的肿瘤靶向小分子肽[c(RGDfK)]  和穿膜TH肽偶联，制备pH敏感脂质体并包载紫杉醇。活 体影像学显示，pH敏感脂质体组治疗的荷瘤小鼠体内肿瘤 抑制率为85.04%,远远高于其他对照组。而Koren等[40]  采用经典的穿膜肽TAT、抗癌抗体2C5同时修饰磷脂，制备 了一种结构更为复杂的pH敏感免疫脂质体，并包载多柔比 星。除了pH响应性，这种多功能脂质体同时还具有良好的 穿膜能力及特异的靶向性。结果显示，在pH5.0条件下，MCF-7细胞和HeLa细胞摄入的脂质体明显高于其在pH 7.4时的摄入，同时实现了多柔比星在肿瘤细胞的有效 富集。

此外，除了对脂质体的外在结构加以改进，为了应对肿瘤的多重耐药性问题，脂质体可包载多种药物。Liu等[41] 利用Her-2抗体修饰pH敏感脂质体，同时包载维拉帕米（异搏定）和多柔比星，有效抑制了Her-2过表达的乳腺癌组织，抑制率提升至83.9%。

3. 2  多肽修饰的 pH 敏感脂质体作为核酸传递的载体
随着核酸研究的发展，例如治疗型质粒DNA、siRNA、miRNA和snoRNA等多种功能性核酸被发现具有重要的医 用价值。但这些核酸分子，特别是RNA容易被体内RNase 降解。利用多肽修饰的pH敏感脂质体对核酸进行包载，可 以提高基因治疗的效果。

Hatakeyama等[42]将GALA连到胆固醇上制备出pH敏感脂质体，并研究其传递siRNA后的基因沉默效果。结果证实，载入siRNA的pH敏感脂质体的体外基因沉默效率与siRNA本身并没有差别，但在小鼠肿瘤组织中效率提高了40%,说明用GALA肽修饰的pH敏感脂质体可以有效保护核酸并将其靶向传递到肿瘤部位。近年来，修饰脂质体的多肽序列设计得更为精妙，功能也愈发突出。例如，Xiang等[43]设计了一种新型的pH敏感型细胞穿膜肽(activatablecell-penetratingpeptide,ACPP)。修饰脂质体的ACPP由中间的蛋白酶切位点连接两端的多聚阳离子／穿膜肽R8和多聚阴离子肽(GHE)4,形成脂质体-R8-酶切位点-(GHE)4 的结构。在肿瘤组织微环境的低pH值下，R8和(GHE)4之间由静电吸引转为排斥。同时，酶切位点被肿瘤组织过表达的MMP2/9切断，R8序列继续保留在脂质体上，行使穿膜肽的功能。这一过程最终促进了ACPP修饰的pH敏感脂质体在特定的肿瘤组织部位被细胞内吞，增强了包装的siRNA对关键原癌基因Plk1的沉默效果。

目前，构建类似鸡尾酒疗法的pH敏感脂质体共传递药物和核酸的研究也在开展。例如，Li等[44]设计的pH敏感脂质体能够同时包载喜树碱和siRNA。Yao等[45]制备了能同时包载索拉非尼、siRNA的pH敏感脂质体。利用pH敏感多肽H6L9修饰的脂质体在“溶酶体逃逸”后，释放的miRNA和喜树碱共同作用于癌细胞，通过下调Hoxd10的表达和对细胞的直接杀伤作用，诱导细胞的凋亡和坏死[46]。

4  结语与展望

多肽修饰的pH敏感脂质体作为药物／核酸载体，具有pH敏感性及对肿瘤组织的靶向性等特征，可实现药物／核酸在肿瘤部位的聚集及快速释放，减少了抗肿瘤药物的毒副作用，提高药物的利用率，具有良好的应用前景。多肽修饰的pH敏感脂质体的发展目前还存在诸多障碍，其稳定性及特异性还有待进一步提高。相信随着研究的深入和制备技术的成熟，研究者能够研制出更高效稳定的pH敏感脂质体应用于肿瘤的临床治疗。

免责声明：本文为行业交流学习，版权归原作者及原杂志所有，如有侵权，可联系删除。文章标注有作者及文章出处，如需阅读原文及参考文献，可阅读中国药学杂志2018年6月第53卷第11期