摘要： 该文探讨了抗氧化肽SS-31对高糖诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响, 体外培养大鼠心肌细胞(H9C2), 给予高糖(30 mmol/L)进行刺激, 并利用抗氧化肽SS-31进行治疗后, 采用Western blot检测Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Nox1、Nox4和Txnip的表达; 利用荧光实时定量PCR(Realtime PCR)检测Bax、Bcl-2、Nox1、Nox4和Txnip mRNA的表达; 采用原位缺口末端标记法(TUNEL)观察H9C2细胞凋亡情况; 应用MitoSOXTM Red染色检测H9C2细胞线粒体ROS产生情况。结果显示, 与正常对照组相比, 高糖组H9C2细胞凋亡明显增加, Bax、 Cleaved caspase-3、Nox1、Nox4和Txnip蛋白表达明显上调, Bcl-2蛋白表达减少, 线粒体ROS产生增加; SS-31治疗后能够抑制高糖诱导的H9C2细胞的凋亡, 下调Bax、Cleaved caspase-3、Nox1、Nox4、Txnip表达, 上调Bcl-2表达并减少线粒体ROS的产生。以上研究结果提示, 抗氧化肽SS-31抑制高糖诱导的大鼠心肌细胞凋亡的同时抑制Txnip/ROS产生, 表明抗氧化肽SS-31可能对糖尿病心肌病变具有一定的改善作用。

SS-31(D-Arg-2’,6’-dimethyltyrosine-Lys-PheNH2)是一种新型的线粒体靶向抗氧化肽, 其分子结构中含有二甲基酪氨酸残基, 具有清除线粒体ROS并且抑制亚油酸和低密度脂蛋白氧化的功能[1]。SS-31可以与线粒体内膜上心磷脂相结合, 调节心磷脂在维持线粒体嵴和呼吸链超氧复合物结构中的作用, 从而增加ATP的产生[2]。此外, SS-31还可以调控心磷脂与细胞色素C的相互作用, 从而防止线粒体通透性改变引起的线粒体肿胀, 并且抑制细胞色素C释放诱导的细胞凋亡[3]。SS-31可以预防脂质氢过氧化物诱导的神经细胞凋亡[4], 而且还可以减少缺血再灌注引起的动物模型中心肌梗死面积[5]。另外, SS-31还可以减轻高脂饮食诱导的肾损伤。SS-31的这些保护作用均与其可以清除线粒体ROS有关。ROS是体内细胞氧化还原平衡失调产生的病理产物, 细胞中的ROS主要由线粒体产生, 过多的ROS可以损伤线粒体膜而进入细胞质, 通过激活caspase级联反应最终导致细胞凋亡[6]。硫氧还蛋白(thioredoxin, TRX)系统调控细胞内氧化还原状态。硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein , TXNIP)是TRX的一种内源性抑制蛋白, TXNIP能通过与TRX活性位点结合而抑制TRX的抗氧化应激活性, 导致线粒体ROS产生增加[7]。目前有研究表明, SS-31可以抑制高糖环境下肾小管上皮细胞凋亡和TXNIP蛋白表达。但是, 关于SS-31对高糖诱导的心肌细胞凋亡及相关机制的研究还少见报道。本实验旨在观察SS-31干预对高糖诱导的大鼠心肌细胞凋亡以及TXNIP/ROS产生的影响。

1 材料和方法

H9C2细胞由中国医学科学院基础医学研究所惠赠。D-葡萄糖、SS-31和MitoSOXTM试剂购自美国Sigma公司。兔抗Nox1和Nox4购自美国Proteintech公司。兔抗Bax、Txnip、Bcl-2多克隆抗体和ECL增强化学发光试剂盒购自英国Abcam公司。Cleaved caspase-3购自美国Cell signaling公司。TUNEL试剂盒、反转录试剂盒和Real-time PCR试剂盒购自美国Promega公司。辣根酶标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术公司。聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluorid, PVDF)购自美国Milipore公司。

1.2.1 细胞培养和分组刺激实验   H9C2细胞在低糖型DMEM完全培养基(含体积分数0.1胎牛血清、105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素)中常规培养。将H9C2细胞分为5组: 正常糖对照组(5.5 mmol/L glucose, NG)、高渗对照组(5.5 mmol/L glucose、24.5 mmol/L mannitol, M)、高糖组(30 mmol/L glucose, HG)、高糖组+溶剂对照组(30 mmol/L glucose+DMSO, HG+DMSO)高糖+SS-31组(30 mmol/L glucose+10 mmo/L SS-31, HG+ SS-31)。于刺激48 h后收集细胞, 进行以下观察。1.2.2 末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口标记法(TUNEL)检测 细胞接种于6孔板中, 并进行分组刺激。具体实验步骤按试剂盒的使用说明书进行。细胞核呈绿色者为阳性细胞, 每孔至少计300个细胞, 计算阳性细胞百分比。

1.2.4 Western blot检测     细胞用冰冷生理盐水洗3遍, 加入细胞裂解液, 冰上裂解40 min, 4 °C、14 000 r/min离心20 min, Lowry法测定上清液蛋白浓度。取细胞裂解蛋白50 μg, 经十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳后电转移至PVDF膜; 5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h, 分别加入Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Nox1、Nox4及Txnip抗体, 4 °C过夜, 洗膜后加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠或兔抗体(1׃10 000稀释), 37 °C孵育1.5 h; 洗膜后加ECL试剂, 用ODYSSEY远红外双色荧光成像系统(LI.COR Gene Company, USA)显影。用ImageJ 1.48分析系统软件(NIH, USA)对Western blot条带进行半定量分析。以目的条带和β-actin条带积分光密度值比值作为最终结果。

1.2.5 MitoSOXTM Red染色 细胞接种于6孔板中, 并进行分组刺激。具体实验步骤按使用说明书进行。用Leica™ TCS SP8共聚焦显微镜采集图像, 用ImageJ 1.48分析系统软件(NIH, USA)对图像进行半定量分析。以治疗组与正常糖对照组平均光密度值比值作为最终结果。

1.2.6 统计学处理 实验数据以x_±s表示, 采用SPSS 21.0统计软件进行统计, 组间比较采用单因素方差分析, P<0.05有统计学意义。

2 结果

3 讨论

糖尿病心肌病变是指糖尿病患者伴发的心肌疾病, 它不能用高血压、冠状动脉粥样硬化或其他心脏病变来解释。糖尿病心肌病变是在患者代谢紊乱及微血管病变的基础上出现的心肌广泛灶性坏死, 进而引发一系列心功能异常临床表现。有研究表明, 一种细胞程序性死亡方式“凋亡”参与了心肌细胞坏死过程, 它是心功能损伤的重要环节, 与心脏疾病的发生及心功能恢复密切相关[8]。因此, 寻求糖尿病心肌病变中抑制心肌细胞凋亡的方法将在一定程度上延缓心脏疾病的发展。

SS-31是一种可渗透性抗氧化剂, 线粒体中SS-31积聚增加可以保护心磷脂和其他线粒体蛋白免受氧化损坏, 这些保护作用可能与SS-31抑制线粒体ROS产生有关, 另外SS-31可以逆转各种损伤引起的线粒体蛋白质组学重塑[2]。SS-31不仅可以维持线粒体结构完整, 而且在细胞内质网应激、脂质沉积、自噬、细胞凋亡等过程中也发挥重要作用[9]。目前关于SS-31治疗心肌病变的研究也有报道。SS-31治疗心肌缺血再灌注大鼠, 可以有效减少梗死面积, 降低心律不齐的严重程度。但是SS-31治疗糖尿病心肌病的作用仍不清楚。我们的实验结果显示, HG能够诱导大鼠心肌细胞凋亡, 上调心肌细胞中Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表达, 同时下调Bcl-2蛋白的表达, SS-31治疗后可以逆转高糖引起的这些变化。这提示, SS-31可能通过减少心肌细胞凋亡而改善糖尿病心肌病变。我们的实验结果与之前的研究结果一致, SS-31可以通过保护线粒体功能, 预防肥胖小鼠肾小球内皮细胞凋亡[10]; 减少胰岛细胞凋亡从而改善胰岛移植后功能[11]; 减少缺血再灌注引起的神经胶质细胞凋亡[4]; 抑制糖尿病小鼠肾小管上皮细胞凋亡[7]。这些结果均说明, SS-31在抑制细胞凋亡过程中发挥着重要的功能, 但具体的作用机制仍需进一步研究。

ROS水平增加会产生明显的细胞毒性, 能够导致细胞凋亡和坏死[12]。ROS在线粒体氧化呼吸链上产生, 需要NADH进行电子传递, 并被NADPH酶消除。除线粒体外, 心肌细胞中ROS还可以来源于NADPH氧化酶、一氧化氮合酶、单胺氧化酶A和黄嘌呤氧化酶等作用产物[13]。目前研究表明, Nox1和Nox4是心肌细胞中主要表达NADPH氧化酶, 在调节心肌细胞氧化应激方面发挥重要作用, 也是目前常用的估算心肌细胞氧化应激水平的指标[14]。SS-31可以清除细胞线粒体中产生的ROS, 从而改善氧化应激引起的各种细胞损伤。我们的结果显示, 抗氧化肽SS-31能够少高糖诱导的心肌细胞中Nox1和Nox4表达, 并减少线粒体ROS产生。表明抗氧化肽SS-31可以调节高糖诱导的心肌细胞氧化应激状态。线粒体ROS产生增加可以增加线粒体膜Ca2+通道的开放性, 使得细胞膜通透性增加, 细胞色素C释放而引起细胞凋亡[15]。据此, 我们推断, SS-31保护糖尿病心肌细胞凋亡可能通过减少线粒体ROS实现。但两者之间是否存在明确关系, 仍需进一步的实验验证。

Txnip是一种硫氧还蛋白相互作用蛋白, Txnip从TRX解离后响应氧化应激而影响多种细胞生物学行为, 如凋亡、转分化[16]和自噬[17]。有研究表明, 在Txnip小干扰RNA转染的心肌细胞中, 细胞活力得到改善, ROS产生减少, 并伴随着过氧化氢酶和MnSOD的表达增加。此外, Txnip小干扰RNA转染可以抑制脂多糖诱导的心肌细胞凋亡[18], 在败血症诱发的心肌功能障碍中发挥重要作用。另有研究表明, 高糖刺激可以减少细胞中TRX和Txnip之间的相互作用, 但增加了NLRP3和Txnip之间的相互作用, 这些改变可被抗氧化剂MitoQ治疗逆转[19]。基于这些观察结果, 我们猜测, 暴露于高糖环境下的H9C2细胞中也可能发生类似事件。为支持这一假设, 我们进行了下一步实验, 结果发现, 高糖刺激增加ROS产生的同时Txnip表达也明显增加, 而且抗氧化剂SS-31治疗后减少高糖诱导的心肌细胞中Txnip表达。目前研究表明, Txnip在高糖诱导的多种细胞凋亡中都发挥重要作用, 如胰岛β细胞、视网膜内皮细胞、肾小管上皮细胞等[20]。这些研究提示, Txnip在调节糖尿病心肌细胞凋亡中可能也具有重要作用, 但具体作用仍需进一步研究。

综上所述, 抗氧化肽SS-31抑制高糖诱导的大鼠心肌细胞凋亡。同时, 抗氧化肽SS-31抑制高糖诱导的大鼠心肌细胞Txnip/ROS产生。我们的研究结果提示, 抗氧化肽SS-31对糖尿病心肌病变具有一定的保护作用, 对临床糖尿病心肌病变的治疗具有一定的意义。

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