摘要 RGD 肽是一类含有精氨酸- 甘氨酸- 天冬氨酸( Arg- Gly- Asp) 的短肽, 作为整合素和其配体相互作用的识别位点, 介导细胞与细胞外基质及细胞之间的相互作用。肿瘤细胞或者新生血管可以特异表达某些整合素如αvβ3, 能以一定的亲和力结合 RGD 肽, 成为肿瘤治疗的新靶点。因此, RGD 肽在肿瘤治疗中的应用已成为研究热点。放射性核素标记的 RGD 肽是一类很有前景的肿瘤显像剂。此外 RGD 肽可以诱导肿瘤细胞凋亡且作为载体在肿瘤靶向治疗中发挥重要作用。
RGD 肽是一类含有精氨酸- 甘氨酸- 天冬氨酸( Arg- Gly- Asp) 的短肽, 广泛存在于生物体内, 其中细胞外基质( ECM) 和血液中的粘附蛋白是人体中最常见的含 RGD 序列的蛋白, 主要包括纤维蛋白(fibrinogen, Fg) 、层粘连蛋白原( vitronectin, Vn) 、胶原( collagen) 等。RGD 肽作为整合素和其配体相互作用的识别位点, 介导细胞与 ECM 及细胞间的粘附作用, 同时具有信号传导功能。目前关于 RGD 的研究主要集中在 RGD 肽对血小板功能的影响、RGD肽在抗栓药物中的应用、RGD 肽在骨组织的诱导再生中的研究、RGD 肽在肿瘤转移和新生血管中的研究以及肿瘤靶向治疗中的应用。本文对 RGD 肽在肿瘤治疗中的进展作一简要的综述。
1 RGD 肽及整合素家族概述
整合素家族是一个膜受体家族, 每个成员的分子都是由 α、β两条链( 亚单位) 靠非共价键连接形成的异源双体跨膜蛋白。现已经发现有 18 种 α亚单位和 8 种 β亚单位。整合素通过与相应配体结合介导细胞与基底膜、细胞与细胞的粘附, 还作为细胞内外信息传递的桥梁。目前已知的 24 种整合素受体中, 大部分与配体结合是通过识别配体所含的 RGD序列。虽然, 不同的整合素受体都能以一定的亲合力与含 RGD 的配体结合, 但是不同的整合素还是能够区分出各自不同的配体。此外, 通过噬菌体库技术,可以筛选出针对不同整合素的配体[1]。在一些肿瘤细胞或者肿瘤新生血管内皮细胞常特异性地高表达某些整合素受体, 如 αvβ3 或 αvβ5, 这类受体可以作为肿瘤靶向治疗的靶点, 利用 RGD 肽竞争结合整合素受体, 抑制肿瘤迁移和肿瘤新血管生成[2]。
2 RGD 肽在肿瘤显像中的应用
肿瘤显像技术对于肿瘤的早期诊断与鉴别诊断、临床分期与治疗有着重要的意义。随着生长抑素受体显像剂已批准应用于临床, 肿瘤受体显像正越来越受到重视。肿瘤受体显像是利用放射性核素标记的配体与存在于肿瘤的特异性受体相结合, 是一种特异性强、敏感性高的分子核医学影像诊断技术。整合素 αvβ3 在多种肿瘤细胞表面和新生血管内皮细胞上有高表达, 但在成熟血管内皮细胞和绝大多数正常器官系统中 αvβ3 不表达或者很少量的表达。因此, 可以设计含有 RGD 序列的肽, 并用放射性核素 125I、99Tcm、18F 等标记, 是一类很有应用价值的肿瘤受体显像剂。为了提高显像质量, 可以在放射性标记的 RGD 多肽中引入 DTPA ( 二乙三胺五乙酸) 、HYNIC( 三羟甲基甘氨酸) 及葡聚糖等基团, 既有利于放射性核素的标记, 又能有效地降低本底[3, 4]。
目前, 肿瘤 αvβ3 受体显像研究大部分处于实验研究阶段, 筛选亲和力更高的 αvβ3 的配体, 即含RGD 的多肽, 是急需解决的重点和难点。实现受体配体一步法标记药盒的制备, 并向临床推广应用, 是本研究领域的发展方向。
3 RGD 肽对肿瘤的直接抑制作用
RGD 肽可以诱导肿瘤细胞的凋亡, 这个过程与caspase- 3 的激活有关。Buckley 等[5]发现 RGD 肽进入细胞后可以导致 procaspase- 3 的自动加工和酶的激活, 直接诱导细胞凋亡。procaspase- 3 自身含有一个潜在的 RGD 结合序列即 Asp- Asp- Met( DDM) ,RGD- DDM 的相互作用引发了 procaspase- 3 的构象变化, 从而导致 procaspase- 3 和 caspase- 3 的激活。此 外 , 被 固 定 的 RGD 肽 对 肿 瘤 坏 死 因 子 (tumornecrosis factor, TNF) 诱导的细胞凋亡的启动过程也有影响[6]。人工合成的 RGD 肽还能够抑制内皮细胞与细胞外基质的作用, 从而抑制肿瘤新生血管的形成。
4 RGD 肽的改造
大多数线性 RGD 肽在循环过程中半衰期较短,其治疗效果和生物活性不够理想。为了获得满意的抗肿瘤效果, 往往需要高剂量的含 RGD 序列的线性肽, 这无疑增加了治疗费用并有可能导致不必要的不良反应。因此, 增加肽类化合物稳定性、提高肽的生物活性, 是对 RGD 肽进行改造的目标。研究表明,将肽的主体或部分结构改为环形结构, 可以增加线形肽的稳定性。含有两个二硫键的环形 RGD 多肽对肿瘤新生血管内皮细胞的抑制效力最强, 是含单一二硫键环形 RGD 多肽的 20 倍, 是线性 RGD 多肽的200 倍[7]。
将 RGD 肽与其他化合物偶联也是增加肽稳定性方法之一。RGD 序列肽与多酸、抗癌药、PEG、PEU、EAA、CEMA 等偶联物偶联后, 其抗细胞粘附和抗肿瘤转移能力增强[8]。
5 RGD 肽作为载体在肿瘤治疗中的应用
肿瘤靶向治疗中靶点、载体和效应分子的选择十分重要。传统的靶抗原多为表达于肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原或者肿瘤特异性抗原。随着“肿瘤生长依赖肿瘤血管”的学说提出, 如今, 以肿瘤新生血管为靶点的抗肿瘤治疗成为热点。如前所述, αvβ3是理想的肿瘤靶向治疗靶点, 其配体 RGD 肽可以作为载体, 携带着效应分子, 抑制肿瘤生长和新生血管的形成。Flavio 等 [9] 将 TNF- α和含 RGD 的多肽ACDCRGDCFCG 融合后, RGD 多肽结合 αv 的能力没有减低, 同时 TNF- α的抗肿瘤特性也得到增强,更重要的是发挥了 RGD 多肽的靶向性, 减少了TNF- α单独使用的不良反应。Li[10]等将通过噬菌体库筛选的与 αvβ3 高亲和力的 RGD 多肽与抗肿瘤抗体的 Fc 融合, 抑制肿瘤血管生成并且具有靶向治疗效果。
肿瘤血管在放射线照射的诱导下, 可以高表达某 些 分 子 如 ICAM - 1 (intercellular adhesionmolecule- 1) 、E- selectin、P- selectin 和[ alpha] 2b[ beta] 3 等, 这些分子也可以作为靶向治疗的靶点。在放射治疗前注射 Tc- 99m- labeled RGD, 由于照射导致[ alpha] 2b[ beta] 3 的激活, 可以发现 Tc- 99m- labeledRGD 在肿瘤部位与受体结合[11]。因此, 通过放射线照射激活肿瘤部位某些整合素的表达如[ alpha] 2b[ beta] 3, 再利用 RGD 肽作为其配体, 将治疗性药物靶向性转运到肿瘤部位, 这也是肿瘤靶向治疗的新思路。
6 RGD 肽在基因靶向治疗中的应用
重组腺病毒载体因具有宿主细胞范围广﹑可插入片段大﹑病毒滴度较高等优点, 广泛应用于基因治疗中, 但在实际应用中, 仍然存在感染效率低﹑缺乏宿主靶向性等缺点, 对其进行改造可以提高腺病毒感染的效率和靶向性。
腺病毒感染细胞有两个步骤: 首先通过病毒衣壳纤维蛋白(fiber) 中的 knob 结构域识别并结合细胞表面的“柯萨奇病毒和腺病毒受体”(CAR) , 介导病毒颗粒与细胞表面接触, 然后通过外壳五邻体蛋白的 RGD 结构识别并结合整合素 αvβ3 和 αvβ5 受体, 通过受体介导的细胞内吞作用使病毒内化。由于有些肿瘤细胞表面的 CAR 和整合素受体表达较低,造成了腺病毒对肿瘤细胞感染效率低。因此, 改造腺病毒的一种策略是在纤维蛋白的 C 端或 knob 结构域的 HI 环处重组上一段 RGD 肽 ( 如 RGD- 4C) , 建立 CAR 非依赖的特异感染途径, 从而提高了 Ad 对肿瘤细胞的靶向性[12]。这种 RGD 修饰的重组腺病毒载体对一些传统的病毒基因治疗效果不理想的恶性肿瘤如骨肉瘤[13]、神经胶质瘤[14]、卵巢瘤[15]、胰腺癌[16], 能够以非 CAR 依赖方式转染肿瘤细胞, 且转染效率大为改善, 为临床基因治疗这类肿瘤提供了可行性。
7 展望
RGD 肽作为整合素和其配体相互作用的识别位点, 其在肿瘤治疗方面有着很好的应用前景。RGD肽能够直接诱导肿瘤细胞的凋亡, 通过对其人工改造可以减少不良反应, 有利于发挥抗肿瘤效应; 利用RGD 肽与整合素 αvβ3 的特异结合, 可以将治疗效应分子靶向性地导入肿瘤部位, 有效地减少了肿瘤治疗中对正常组织细胞的损害; RGD 肽还可用于腺病毒结构的改造, 从而提高腺病毒转染的效率和选择性。此外, 放射素标记的 RGD 短肽也是一类很有前景的肿瘤显像剂。但是, RGD 肽在肿瘤治疗的应用尚处于起步阶段, 其作用机制还有待深入研究, 而且很多研究和临床应用仍有一定距离, 其中筛选出亲和力更高的整合素配体, 即含 RGD 的多肽是关键性的问题。随着噬菌体库技术的不断成熟以及新的筛选技术, 相信含 RGD 肽是一类很有前景的肿瘤治疗药物, 其在肿瘤诊断和治疗方面的应用也会更加深入。
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