摘要:病菌感染严重威胁着全人类的生命健康,由于抗生素的滥用导致耐药菌不断滋生,传统抗生素药物开发迟滞,迫切需要开发新型抗菌分子。利用化学方法构建抗菌高分子材料或抗菌药物的递送体系,是对抗耐药菌的有力武器。本文重点介绍了近年来各类抗菌高分子材料在设计、合成方面的研究进展,以及在对抗病菌耐药性危机中的应用方向和前景。
细菌遍布于我们的生存环境中,其中大部分可以与人类和平相处,但仍有众多致病菌会引起各类疾病,在漫长的人类历史中,这些隐藏在人类身边的杀手通过一道小小的伤口便能导致致命感染。直到1928年,AlexanderFleming发现青霉素,并于20世纪40年代投入临床使用,我们进入“抗生素时代”,各类抗生素药物相继问世,使人类拥有了抵抗病菌感染的有力武器[1] 。然而好景不长,人类对抗生素长期过量和不恰当的使用,急剧加速了病菌耐药性突变的发生,各类耐药菌不断出现,最终,具有多重耐药性的“超级细菌”问世,使细菌感染的治疗难度增大[2] 。据世界卫生组织(WHO)2019年发布的报告,全球目前每年至少有70万人死于耐药性病菌感染,若以目前的趋势继续发展,到2050年全球每年死于耐药菌感染的人数可能会增加到1000万人/年[3] 。据世界银行计算,以现在趋势到2050年,抗生素耐药性问题造成的全球经济损失每年将超过2万亿美元[4] ,对粮食和饲料的生产、贸易等方面的影响更是不可估量。
然而根据美国食品药品监督管理局(FDA)的数据显示,自1980年之后鲜有新抗生素药物进入市 场[5] ,一方面是迅速发展的病菌耐药性使得已有抗生素失效,另一方面是新药研发的艰难和迟缓。2014年,WHO宣布人类已进入“后抗生素时代”[5] 。除了加强政府监管与宣传,引导卫生系统、农牧业和公众 正确看待并科学使用抗生素之外,迫切要求研究者们积极探索新的抗菌材料和方法来应对这一危机。近 年来,基于高分子材料的新型抗菌材料和药物递送体系逐渐成为研究热点,通过天然高分子修饰、合成抗 菌多肽及其高分子类似物、抗菌药物递送载体、光动力抗菌疗法等可以有效杀灭病菌,阻止/减缓耐药性 的发生。本文将对上述基于高分子的抗菌材料和方法进行总结和概括,以期为寻找破解病菌耐药性危机 可行方案提供启示。
1 天然抗菌肽及其作用机制
1974年,瑞典科学家G.Boman等从眉纹天蚕蛾蛹(samiacynthia)提取出一种具有抗菌活性的多 肽:天蚕素(Cecropins)———这是世界上最早发现的天然抗菌肽(Antimicrobialpeptides,AMP)之一[6, 7] 。之后大量研究发现,多种多样的抗菌肽广泛存在于动物、植物和微生物的免疫/防御系统中,因此也被称为宿主防御肽(Host-defensepeptides,HDP),截止到目前,已经有3000余种抗菌肽被报道[8] 。这类抗菌肽被称为“新一代的抗生素”。不同于传统抗生素的是,抗菌肽在长期(几千甚至数万年)发挥作用的同时,并没有引起病菌的耐药性,有科学家认为这与抗菌肽与细菌细胞膜作用的独特抗菌机制有密切的关联。
虽然目前已发现了3000余种抗菌肽,但是真正应用于临床的却很少。这是由于一部分抗菌肽在作用剂量下对原核生物和真核生物都会体现毒性,对哺乳动物会产生溶血等毒害作用。另外,抗菌肽在动物体内容易被蛋白酶水解,在高盐环境、二价阳离子等影响下会形成聚集体;并且抗菌肽的提取和纯化较为困难且昂贵。为克服抗菌肽的这些缺点,研究者们致力于通过化学方法模拟抗菌肽的结构和功能,来人工合成抗菌聚肽、类肽和它们的高分子模拟物;大量研究也已经表明,化学方法可以以低成本合成出具有广谱抗菌性和高选择性的抗菌肽及其类似物[15] 。
2 抗菌高分子材料
近年来,随着对抗菌材料的研究不断深入,高分子材料逐渐突显出其优势。我们将从抗菌聚多肽/聚氨基酸、抗菌天然高分子及其衍生物、抗菌肽的高分子模拟物、基于高分子的抗菌药物递送体系以及光动力抗菌高分子材料这几个方面,综述近年来抗菌高分子材料的研究进展。
除上述采用NCA法合成抗菌肽之外,科研工作者还不断开发出新的抗菌肽合成方法。中科院应化所陶友华等开发出一种内酰胺合成多肽的方法,并成功合成了传统NCA法无法合成的ε-聚赖氨酸(ε-PL)抗菌肽,解决了无法使用化学方法合成直链ε-PL这个公认性难题[25] 。
自然界中存在大量的天然高分子化合物,其中一些具有一定的抗菌性能。最常见的天然抗菌高分子 如壳聚糖,是一种带正电荷的直链型多糖,由甲壳素经浓碱处理脱去乙酰基后得到的,主要来源于蟹壳、虾壳、贝壳等甲壳类壳体。壳聚糖的氨基可以在低pH下被质子化而带正电性,具有一定的抗菌效果。但是在中性生理条件下,壳聚糖溶解性很差,很难发挥其抗菌效果,所以需要对其进行化学修饰,从而得 到抗菌活性高、溶解性好的壳聚糖衍生物。
壳聚糖分子结构中含有活泼的羟基和氨基,具有很高的反应活性,通过季铵盐化、季鏻盐化、胍基化等方式与其它化合物的改性修饰,制备得到不同的壳聚糖抗菌衍生物[32~34] 。Li等报道了以癸基二甲基胺壳聚糖(高度季铵化)接枝聚甲基丙烯酸乙二醇酯(DMDC-Q-g-EM)和聚二丙烯酸乙二醇酯为基础的抗菌水凝胶(如图4所示)。该凝胶对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、腐皮镰孢霉菌等都具有良好的抗菌效果,并提出了一种物理抗菌机制,阴离子细菌膜部分像负离子海绵一样被吸进水凝胶的内部纳米孔中,导致微生物膜破坏,进而导致微生物死亡。此外,动物实验表明,DMDC-Q-g-EM水凝胶涂层与家兔结膜具有良好的生物相容性,对上皮细胞和底层基质无毒性[34] 。
El-Newehy以氯乙酰化和溴乙酰化壳聚糖为原料合成了一系列季铵盐和季鏻盐,并研究了它们对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌的抗菌活性,在相同的反负离子条件下,季鏻盐改性壳聚糖对所测微生物的抗菌活性高于季铵盐改性壳聚糖[33] 。Niu则利用羧甲氧基聚乙二醇(mpEG-COOH)在壳聚糖结构中引入亲水片段,通过氨基亚胺甲烷磺酸(AIMSOA)对壳聚糖进行胍基化,制备了双功能壳聚糖衍生物CS-G/mpEG,它可以在不引起溶血或细胞毒性的情况下,通过高效选择性地破坏细菌膜杀死革兰氏阳性菌,在较宽的浓度范围内有效抑制金黄色葡萄球菌的生长,并且其溶解性也得到了提高[32] 。
甲壳素也是带正电荷的天然含氮多糖高分子,与壳聚糖一样,分子结构中也含有活泼的羟基和氨基,可通过化学改性得到甲壳素抗菌衍生物。Cai课题组采用简单的方法在KOH/尿素水溶液中简单地制备了一系列季铵化的β-甲壳素衍生物。它们对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和米根霉均表现出良好的抗菌活性,MIC分别为8、12、60和40μg/mL,并且具有良好的生物相容性[35, 36] 。
天然高分子的修饰有其局限性 , 而利用高分子合成方法 , 通过对单体的修饰和调配 , 来理性模拟抗菌 肽的两亲性结构则具有更强的操作性和可控性 。
为了更接近地模拟抗菌肽,Degrado和Tew等设计合成了一种新型抗菌低聚物———“折叠体”,其为一种基于芳胺和β-氨基酸骨架的短序列特异性寡聚物,在具有两亲性组分的同时,还能折叠成类似抗菌肽的二级结构,可通过调整分子结构优化来调节抗菌活性和毒性。之后将这些抗菌折叠体作为静脉注射抗生素,结果表明,细菌不易对这类化合物产生耐药性。然而,在对这些抗菌折叠体的性能筛选中发现,有一些二级结构与其抗菌肽母板不太相似的分子也具有良好的生物学性能[45] 。基于这些成果,研究人员开拓了抗菌肽高分子模拟物的设计与合成。
Lienkamp等将一系列不对称二取代的二衣康酸单体与N, N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)通过自由基共聚合,得到抗菌肽模拟共聚物(SMAMPs)。结果表明,通过改变烷基链长度与DMAA含量可以改变聚合物的疏水性,当烷基侧链最长、DMAA含量最低时,抗菌活性最强。由于这些聚合物生物活性的分子量依赖性,需要进一步优化的是多分散性,可以通过可控自由基聚合的方法来实现o Tew采用开环转位聚合(ROMP)制备了一系列具有不同结构变化的聚合物,通过对结构与活性关系的研究,分析分子量、电荷、疏水性、反离子和聚合物结构对抗菌效果的影响[47] o。抗菌研究表明,随着聚合物疏水性的增加,其MIC值开始呈上升趋势,当聚合物链中间部分疏水时,其抗菌活性最高;与单电荷模拟物相比,单体含有更多阳离子电荷的聚合物具有更高的抗菌性;分子量对抗菌性能的影响可能与聚合物结构有关[48]。
yang 和 Hedrick合成的抗菌聚碳酸酯能够选择性地与细菌细胞膜相互作用 , 首先通过静电膜缔合 作用诱导膜整合 , 进而使膜不稳定 , 最终导致细菌细胞裂解和死亡o 抗菌聚碳酸酯对革兰氏阳性菌 、革兰 氏阴性菌和真菌都有选择抑制的能力[49] 。
如今已经开发出许多具有选择性的抗菌肽聚合物 , 由于聚合物中阳离子电荷和疏水性之间的平衡 , 使得它们能选择性地与细菌的阴离子脂质膜 , 而不是与两性离子哺乳动物(人的红细胞)膜作用o 为了探 究两亲性抗菌聚合物中的氢键是否有助于这种特异性膜的结合 , Divakara 等通过酯的异构取代 , 使其酰 胺部分在 N-烷基马来酰亚胺基两亲聚合物的侧链中的氢键效力不同o 研究表明 , 与酯对应物(EC3P)相 比 , 酰胺聚合物(AC3P)是一种有效的抗菌剂 , 具有高的破膜性能 , 证实了氢键在细菌膜相互作用中的重 要作用 , 这将助于今后设计特异性膜活性分子的细菌膜[50] 。
卤胺抗菌化合物近年来也被广泛关注,它是一种分子结构中含有氮卤官能团的有机化合物,通常由N—H键经次卤酸盐作用转变成N—X键来制备。其抗菌原理是由于卤原子带有正电荷且具有氧化性,通过释放强氧化性的卤素阳离子破坏细胞膜,或进入到微生物体内,干扰细胞酶的活性和代谢过程,从而导致细菌死亡。Ren课题组在N-卤胺抗菌共聚物及抗菌剂的制备方面持续探索,利用壳聚糖和羟甲基海因作为原料反应生成了卤胺前驱体接枝壳聚糖[51] ,又通过离子凝胶法制备了改性壳聚糖纳米微球,后又将改性壳聚糖纳米微球氯化,结果显示,改性后的纳米微球具有更加优异的抗菌性能。除此之外,改性后的壳聚糖以偶氮二异丁腈为引发剂,合成了卤胺抗菌剂 3-(3,-丙烯酸丙酯)-5,5-二甲基海因(APDMH)[52] ,并与乙酸乙烯酯(Vac)共聚,合成了抗菌共聚物[P(APDMH-c.-VAc)],通过浸渍工艺,整理到丙纶无纺布上。Dong课题组致力于开发抗菌N-卤胺材料,采用自由基共聚,合成负载N-卤胺的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)纳米粒子作为新型抗菌剂,这种抗菌剂具有长期稳定的抗菌性能[53]。
除了本身具有抗菌功能的高分子 , 利用高分子来做为抗菌药物(如抗生素 、抗菌肽等)的智能/靶向递 送体系 , 实现抗菌药物的按需释放 , 可以大幅降低药物的用量 , 避免药物的持续过量使用 , 对于降低病菌 耐药性的发生 , 也具有极其重要的意义 。
saad报道了一种将水凝胶作为抗菌环丙沙星药物(CFX)载体的制备方法,合成了N-三甲基壳聚糖(TMC)/羧甲基黄原酸钠胶(CMXG)水凝胶,并以环丙沙星作为模型药物。结果表明,环丙沙星成功地从制备的水凝胶中掺入和释放。为了防止体内植入器械感染等一系列问题[54] ,Ashbaug开发了一种由嵌入在聚己内酯(PCL)薄膜中的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米纤维组成的复合涂层,用于协同传递抗生素。通过改变PLGA:PCL聚合物的比例,可以递送不同种类的抗生素[55] 。同样的,脂质体也是一种重要的药物递送载体,Chhibbe采用脂质体作为噬菌体的载体在小鼠体内培养噬菌体抗体,并对混合血清中和游离噬菌体和脂质体夹持噬菌体的能力进行评估。实验结果显示,包封的噬菌体的中和抗体具有100%的保护作用。游离的噬菌体在与抗体相互作用后3h内被中和,并且,脂质体能够将包住的噬菌体运送到巨噬细胞内,导致细胞内94.6%肺炎链球菌死亡。纳米颗粒在递送抗生素和其它药物方面表现出很多优异的性能,但其靶向效率等有待进一步提高[56] 。
光能具有环保性 、可再生性 、远程操控和可调节波长等优点 , 因此光响应性高分子材料成为研究热点 之一 。光动力抗菌化学疗法(Photodynamic antibacterial theraPy, PDAT)是利用光敏剂和可见光或紫外 光 , 通过氧化损伤对微生物产生光毒性反应[60] 。PDAT如果能够替代抗生素用于局部感染的治疗 , 将有 效缓解耐药性危机 。目前 , 卟啉类及其衍生物是一类非常重要的光敏剂 。然而 , 卟啉很容易在疏水的 π-π 相互作用的基础上形成聚集体 , 减少单线态氧的生成 。 为此 , zhang 课题组以含有葫芦[7](CB[7])季 铵盐基的卟啉衍生物(Por)为原料制备了一系列超分子光敏剂 。 当其与 CB[7]结合后 , 光敏剂的抗菌活 性在黑暗中处于关闭状态 , 而在白光照射下抗菌活性处于开启状态 。 实验结果表明 , 这些小分子对哺乳 动物细胞几乎没有细胞毒性 , 这一研究方向将为季铵盐类杀菌剂长期对抗细菌积累提供一种新策略[61] 。
由于具有良好的光物理性质,阳离子共轭聚合物被广泛应用于生物传感器、成像和生物医学等领域。wang课题组合成了一种新型阴离子水溶性聚噻吩(PTP)和一种阳离子卟啉(TPPN),两者通过静电相 互作用形成复合物,如图8a所示,在白光照射下,PTP向TPPN进行有效的能量转移,提高了TPPN产 生单线态氧的效率,能够有效地进行杀菌[62] 。为了更好地选择性识别、成像和杀灭细菌,他们又合成了 一种具有聚乙二醇侧链(PPV-1)的多功能阳离子衍生物,如图8b所示,阳离子PPV-1通过静电相互作用 选择性识别结合细菌,在白光照射下产生三线态氧,进而氧化损伤有效杀死细菌[63] 。APDT存在的主要 问题是光在生物组织中的穿透深度有限,为此构建了一种基于电化学发光(ECL)的电致发光杀菌系统, 如图8c所示。ECL可用于激发光敏剂,OPV作为一种高效的光敏剂,吸收ECL的发射,不再依赖于物 理光源产生活性氧(ROS)。这种新策略避免了外部光源的使用,在深部组织损伤治疗中具有很大 潜力[64] 。
除卟啉类及其衍生物、阳离子共轭聚合物外,常见的光敏剂还有吩噻嗪类、酞菁类及其衍生物等。传统的吩噻嗪类光敏剂包括亚甲基蓝、甲苯胺蓝等。Syed利用670nm激光光源,研究了亚甲基蓝共轭碳纳米管(MBCNTs)对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生物被膜的抗菌活性。在试验培养基中,光动力失活显示大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的log值分别减少4.86和5.55[65] 。另外,Terada等探究了在白卤光的激发下,光敏剂赤藓红素/亚甲基蓝联合应用对变形链球菌生物被膜的抗菌作用,研究结果显示,当赤藓红素和亚甲基蓝的浓度为100μM和250μM时,PDAT联合赤藓红素/亚甲基蓝均优于光敏剂单独使用的效果[66] 。酞菁类化合物与卟啉结构相类似,已被用作光敏剂。为此,Lee制备了壳聚糖/三聚磷酸盐纳米粒子包封酞菁,对白色念珠菌进行杀灭。包封的酞菁穿透细胞的能力增强,实验结果显示白色念珠菌的存活率仅为20%[67] 。
上述各类抗菌高分子,在进一步作为药物代替抗生素应用于临床方面还面临很大的挑战。但目前,各色各样的抗菌高分子材料可以通过抗菌涂层等方法应用于医疗器械、卫生消毒、水处理等领域,从而减少抗生素的用量,延缓其耐药性的产生。例如,应用于临床手术,通过对手术室内用品、器具进行抗菌涂层修饰,可以达到较高的洁净等级,减少感染的发生,减少/避免抗生素的使用,从而减缓耐药性的滋生。
3 总结与展望
目前,抗菌高分子材料的研究主要集中在它们的化学和结构方面。随着研究的深入,性能优异的抗菌高分子材料正在被不断开发出来。
高分子材料可以作为智能/靶向药物递送体系,将药物精准递送到感染部位,高效发挥药物作用,避免药物的过量使用,从而降低病菌耐药性的发生。同时,由于光动力抗菌疗法具有副作用小、选择性好等优点,近年来受到极大关注。光敏剂在一定波长的光的激发下,产生ROS,进而杀菌。
抗菌高分子材料的研究得到了长足的发展,但仍存在一些问题,如抗菌聚合物的抗菌机理尚未完全清楚,需要进一步研究;药物递送体系的靶向性也有待提高。抗菌高分子材料在生物医药和生产生活中的应用,也有待进一步探索和推进。通过研究者的不断深入研究和探索,如果抗菌高分子材料可以用作药物来代替抗生素的使用,将很大程度上降低/减缓耐药性的发生,破解病菌耐药性危机。
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