摘要：基于多肽和蛋白质的水凝胶体系作为生物材料的一个重要种类,受到了广泛关注,近年来更得到了 长足的进步。其凝胶化的机制既可以是侧基之间的物理组装和聚集,也可以是反应性残基之间的可控化学反 应。两者协同作用可进一步促进其功能改性。多肽和蛋白质独有的生物活性及其结构和功能上的多样性和可 调性为生物材料的发展提供了诸多可能,展现出广泛的应用前景。本文对基于多肽和蛋白质的水凝胶的设计、制备和应用等研究进展进行了简要的介绍与总结,并对该领域的进一步发展进行了展望。

引言：材料科学与生命科学的交叉,推动了生物材料的迅猛发展。水凝胶是一类非常重要的生物材料。它 是由亲水性三维网状结构与大量水构成的独特分散体系,能够在水中溶胀而不溶解。多数软组织就是由 蛋白质和聚糖等生物高分子组成的水凝胶。因此,水凝胶在生物医学领域,特别是药物释放、组织工程、再生医学、生物传感器、柔性促动器以及人工细胞外基质等方面具有广泛的应用前景[1~3] 。近年来,基于 多肽和蛋白质的水凝胶,因其结构上的精确性和功能上的多样性得到特别的关注,本文将就该体系做简 要的介绍和总结。

1   背景

构建水凝胶可以通过物理交联和化学交联的方法 。前者基于非共价键相互作用 , 如静电作用 、疏水 作用 、氢键等作用;后者则是基于共价键作用 。评价水凝胶作为生物材料的应用前景的两个方面是生理 活性和机械性能[4, 5]  。生理活性主要取决于高分子的组成 、分布及其与细胞之间的相互作用;而机械性能 主要取决于交联点的强度和密度 。两者直接影响细胞的生长和分化行为[3,  6]  。近年来 , 围绕水凝胶的功 能化和机械性能改性涌现了很多出色的工作 。一方面 , 人们通过加入纳米复合物或大分子聚集体参与交 联[7]  , 改变交联点的性质 , 结合两个甚至多个性质互补的网络[8, 9]  或者利用不同交联机理协同作用[10, 11]  等方法来改进水凝胶的力学性能;另一方面 , 通过引入具有生理活性的基元并控制它们在时间空间上的 表现来改进水凝胶的生理活性 。综合调控这两方面的性质是水凝胶研究的重要方向 。

多肽和蛋白质均为一类由α-氨基酸以肽键相连而成的化合物。一般把含有100个(有时是50个)以 上氨基酸的多肽称为蛋白质。它们在体内起到了极为重要的生理功能,可以说是构成生命的物质基础。

虽然其组成仅包含20种天然氨基酸,它却能在生命过程中起到复杂多样的关键功能。这主要归因于其精确的序列结构和多级的空间结构。氨基酸上不同性质的官能团(疏水、亲水、电中性、电负性、极性基团)的微妙平衡和巧妙结合正是蛋白质能进行有序折叠和实现多种功能的关键。

多肽可以通过固相合成,也可以通过蛋白质降解得到。多肽的固相合成虽然只适用有限长度分子的合成(通常小于50个氨基酸),但是可以方便地引入各种非天然氨基酸[12] 。蛋白质的生物合成则是由DNA的转录与翻译实现的一个高度精确可靠的模板聚合反应。现代基因工程和重组蛋白质生物合成的迅猛发展为蛋白质生物材料研究提供了很好的基础,而蛋白质工程更进一步拓展了其可修饰性和功能性。例如,schultz组[13,14]与Tirrell组[15,16]成功将非天然氨基酸引入蛋白质,为设计与操纵特殊蛋白质提供了极大的便利。定点突变和定向进化等技术的成熟更容许人们对于同一种蛋白质的性质进行改进和微调,其结构和功能控制的精确水平是合成高分子体系里所不能比拟的。

2   基于多肽/蛋白质-合成高分子的水凝胶体系

合成高分子虽然不具有生物大分子的结构精确度 , 生理功能也相对有限 , 但是其单体结构复杂多样 , 也比较容易修饰并实现量产。现代可控聚合技术的发展更提供了控制合成高分子分子量 、分散度等重要 结构参数的多种有效方法。因而 , 合成高分子与多肽和蛋白质在作为材料方面具有很多互补的优点 , 其 复合水凝胶体系也备受关注。Michael加成 、点击化学[17] 等一系列快速高效的化学修饰手段为创造复合 水凝胶提供了合适的手段 , 架起了合成体系和生物体系之间的桥梁 , 促进了这个方向的蓬勃发展。

PEG是一类 具 有 很 好 生 物 相 容 性 的 水溶性合成高分子 , 被广泛应用于生物高分子的改性和制备水凝胶。基于 PEG 的水凝胶因而被认为是水 凝胶体系的“金标准”。已有很多工作将 PEG 和多肽或蛋白质结合在一起制备水凝胶。最常用的反应是 基于半胱氨酸的巯基或者赖氨酸的氨基的反应。例如 , Hubbell组通过 PEG 的乙烯砜端基与含有精氨 酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(RGD)多肽片段上的巯基之间的 Michael加成实现凝胶化 , 发展支持细胞黏附 与酶降解的细胞外基质[20~22]  。该体系中还引入了能够被基质金属蛋白酶(MMP)或血浆酶特异性降解 的多肽序列 。不同多肽序列的降解速率不同 , 以此就可以调节体系的降解速率。该体系被成功应用在细胞培养过程 。结果表明 , 细胞在更容易被降解的水凝胶中舒展和迁移的速度更快 。

相比于点击化学 , 酶催化的可控偶联也许和细胞过程更为兼容 。比如谷氨酰胺转胺酶可以有效地催 化谷氨酰胺和赖氨酸之间的异肽键形成 。Ehrbar与 Lutolf、weber等制备了两种八臂 PEG, 其末端分别 携带两类多肽:一类含有谷酰胺受体底物(Gln),一类是含有供基质金属蛋白酶降解的多肽序列的赖氨酸 底物(Lys)。两种大分子在谷氨酰胺转胺酶的作用下共价相连 , 就可以形成网络结构 。因为这个方法也 适用于和生物大分子的共价偶联 , 所以该复合水凝胶也可被用于固定含有特定标签的融合蛋白 , 比如捕获人胚肾细胞(HEK-293T)分泌出的标签生长因子 。加载了生长因子的水凝胶体系可以作为指导细胞 行为的智能人工细胞外基质[29]  。

蛋白质相互作用也是构建复合水凝胶的有效驱动力 。组报道了利用卷曲螺旋聚集交联的 蛋白质-高分子复合水凝胶[36]  。该体系组成为 N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺和 N-(N’,  N’-二羧甲基氨丙 基)-甲基丙烯酰胺两种单体的共聚物(HPMA-co-DAMA),以及具有卷曲螺旋(coiled-coil)结构的两种蛋 白质 CC1 与 CC2。其中 CC1 来源于驱动蛋白的茎部区域(~150个氨基酸), CC2则是基于从头设计的 多肽链(~50个氨基酸),具有极高的热稳定性 。蛋白质与合成高分子之间首先通过组氨酸标签和高分 子侧链羧基之间的 Ni2十 离子配位络合接枝相连 , 而卷曲螺旋的进一步聚集则有效导致了物理凝胶的形 成 。这种方法具有一定的普适性 , 也适用于比如 zn2十 、Ca2十 、Mg2十 等离子 , 将有可能允许体系作为生物环境下对金属离子响应的微型传感器 。

总的来说 , 制备蛋白质-高分子复合水凝胶 , 主要是为了利用蛋白质的生物活性和合成体系的易制备 和易修饰性 , 这类体系具有一定的促进细胞生长与分化的能力 。目前的挑战主要在于进一步开发和利用 与生物过程相容的化学反应 , 在最大程度保证蛋白质生理活性的基础上实现凝胶化 , 并进一步改进机械 性能 , 实现水凝胶功能多样化 、图案化和智能化 , 更好地模拟天然细胞外基质的特性 , 开拓其在组织工程 中的运用 。

3   完全基于多肽和蛋白质的水凝胶体系

多肽或蛋白质与合成高分子的复合水凝胶体系结合了两者的优点 , 但是在不影响生理活性的前提下 实现可控偶联的方法相当有限 。同时 , 对于大多数体内应用来讲 , 合成高分子的生物相容性及可降解性质等也需要慎重考虑 。因此 , 完全基于多肽或蛋白质的水凝胶体系成为一个非常吸引人的方向 。它取法自然 , 能够更好地对生物体系进行模拟 。

多肽的自组装是丰富多彩的。多肽的组成并不限于传统的20种天然氨基酸,还包括各种非天然氨基酸。同时,即使仅含有数个残基,多肽仍然可以展现强烈的组装现象,形成有序结构。徐兵和杨志谋等[41]构建了D构型的四肽,这种四肽具有萘基端基ADA苯丙氨酸ADA苯丙氨酸ADA赖氨酸ADA酪氨酸的结构,能够结合紫杉醇等生物活性分子。磷酸化的多肽前体一经去磷酸化,就能组装形成具有纤维骨架的凝胶。由于D型氨基酸有一定的抗降解能力,该体系能够长时间保持稳定,并缓慢释放药物。ulijn等[42]仅利用一种末端是芴甲氧羰基(Fmoc)的二肽,就实现了多肽凝胶化过程,其中π-π相互作用被认为是凝胶化的关键。随后Gough与ulijn等将芴甲氧羰基-二苯丙氨酸多肽(FmocFF)与芴甲氧羰基-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽(Fmoc-RGD)的水溶液混合,也得到了具有纳米纤维结构的水凝胶,并可用于增强封装在其中的人类真皮成纤维细胞的增殖与生长[43,44] 。

多肽也可以通过更为复杂的二级结构的相互作用实现凝胶化。多肽β折叠的有序组装率先激发了研究者对多肽凝胶的研究。例如,具有16个谷氨酸(E)-甘氨酸(A)-赖氨酸(K)重复单元的多肽(EAK16),可以通过多肽链间氢键作用形成β折叠的平面,这些平面再通过残基间的静电作用进行堆叠,从而形成特定的三维结构[45~46] 。另一种IsK蛋白中的转膜结构域具有富含赖氨酸的多肽片段,也能够基于上述方式形成凝胶[47] 。在该工作中,Aggeli等把能够发生凝胶化的多肽体系的理性设计总结为三个原则:(1)不同链的侧基间要具有吸引力(如疏水相互作用、静电相互作用、氢键作用、π-π堆叠等);(2)肽链段侧基在某方向上(通常为垂直于β折叠平面的方向)具有一定的识别作用,可以限制一个方向上的自组装;(3)结构表面要对溶剂分子有较强的吸附性[47] 。

多肽水凝胶的进一步功能化也是研究者青睐的热点 。张曙光等[51] 发现具有纳米纤维结构的多肽水 凝胶体系可以包藏并缓释溶菌酶 、免疫球蛋白 G 等不同结构不同电性的蛋白质 , 其缓释速度取决于蛋白 质大小而非蛋白质电性 , 并且释放的蛋白质仍可以保持原来的高级结构[52]  。这说明方法具有一定的普 适性 , 换言之 , 通过合理设计调整水凝胶的骨架尺寸 , 就可以精确调控其缓释过程[53]  。这为研究细胞生 理和组织工程提供了有利的平台 。但是另一方面 , 相比蛋白质而言 , 多肽在其生理功能多样性和生物过 程的角色上都比较有限 。因此 , 全蛋白质水凝胶的研究也正方兴未艾 。

基因重组和生物合成手段的成熟使得重组蛋白质的制备和性质调控变得常规。在生物体内,蛋白质基元之间的交联是形成细胞外基质和其它蛋白质材料的重要过程。因此,完全基于蛋白质的水凝胶可以最大程度地模拟人工细胞外基质和利用天然蛋白质的生物活性。目前,多数全蛋白质水凝胶都是基于可控确定的蛋白质-蛋白质相互作用或较不规整的蛋白质聚集所形成的物理交联。前者如亮氨酸拉链(Leucinezipper)的聚集作用[54,55]、二价离子耐受蛋白(cutA)的三聚[56,57] 以及钙-钙调蛋白(calmodulin)的结合等[58] ,后者如弹性蛋白的热聚集[59] 和富含脯氨酸的肽段的聚集等[60] 。

亮氨酸拉链(Leucine zipper)是一种能形成卷曲螺旋结构的蛋白质,由多个71 螺旋聚集形成,其七 元重复单元可以表示成abcdefg,其中两组螺旋的a与d为疏水基团,通常为亮氨酸,e与g为带电残基 (见图10a)。它们通过亮氨酸的疏水作用形成卷曲螺旋。Tirrell组利用亮氨酸拉链的疏水相互作用作 为交联手段,设计了三嵌段组蛋白质基元Ac10A[61] (见图10b),A代表亮氨酸拉链,c10代表亲水柔性链。它可以形成水凝胶,并具有pH响应性。当pH升高时,亮氨酸拉链A上谷氨酸的离子化使亮氨酸拉链 解聚。核磁表征进一步发现,体系中水溶性的柔性链段是动态变化的,而亮氨酸拉链则表现为比较刚性 的结构,这与设想的结构是相吻合的[62] 。

Kennedy等发现亮氨酸拉链存在二聚体-四聚体的平衡 , 这些聚集体共同构成了水凝胶的物理交联 点 , 中间柔性肽链的水溶性可以防止多聚体的无规聚集析出[63]  。然而 , 在开放溶液环境中 , 蛋白质会逐 渐以环状中间体的形式溶解到溶液中去 。为了稳定此类水凝胶 , 他们将亮氨酸拉链 A 重复单元上的 d 位氨基酸突变为半胱氨酸(见图 10c)。因为 A倾向于反平行聚集 , 这种设计使之更倾向形成分子间二硫 键而非分子内二硫键 , 减少了成环的可能性 , 提高了水凝胶的稳定性[64]  。

利用天然蛋白质的反应性残基也可以实现交联的全蛋白质网络。同时,对蛋白质的简单修饰可以允 许以多种多样的方法来实现凝胶化。虽然这并不完全是全蛋白质基水凝胶,但它大大拓展了蛋白质基水 凝胶的范畴和功能,提供了其改性的新思路。例如,自然界中的贝类能够牢牢固定在岩石上,主要归功于 其贝类黏附蛋白(MAP)中关键成分3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)的存在,其原理被Messersmith等在基 于PEG体系的合成高分子水凝胶中已有体现[73,74] 。Cha组进一步在蛋白质体系里也做了详细的工作。他们首先利用蘑菇酪氨酸酶对重组fp-1型MAP进行后修饰,获得含有DOPA的MAP蛋白质[75] 。它 既能与Fe3+ 形成多齿配合物[76,77] ,又能在氧化条件(如IO4- )下形成共价交联。这为全面提升全蛋白质 水凝胶的粘附性和机械性能提供新的一种思路。

由此可见,具有高度特异性和强亲和力的蛋白质-蛋白质相互作用在全蛋白质水凝胶中可以发挥其强大的功能。通过基因工程的方法可以编辑凝胶前体的结构和功能,而生物合成则保证我们能够简便地获得具有相应结构和功能的凝胶前体蛋白质。两种方式结合,能够更加快速简便地获得不同功能的凝胶前体蛋白质,从而实现模块化构建全蛋白质水凝胶。例如,在前体蛋白质中嵌入一段结构域,同时在另一前体蛋白质中引入与之结合的互补结构域,就可以结合不同的功能蛋白设计重组融合蛋白质,以制备功能性水凝胶。结构域之间结合的不同动力学和不同稳定性可以被用来微调水凝胶的宏观性质。

4   总结与展望

在近几十年的科学道路上,蛋白质工程经历了飞速的发展,而材料研究也日新月异。可以说,对合成高分子水凝胶的研究已经相当成熟。目前,生物大分子-合成高分子的复合水凝胶方向取得了相当大的进展,完全基于多肽和蛋白质的水凝胶体系也正日新月异。有理由相信,利用蛋白质的优势构建水凝胶材料,在未来仍具有极其广阔的前景以及应用潜力。然而该领域仍然存在一系列重大的挑战。首先,如何找到一种合适、简便可行而又生物相容的凝胶化方法,以适应广泛的生物用途? 其次,如何利用其特殊的功能性,为体系增添丰富的刺激响应性和智能性,进一步提升蛋白质水凝胶的生物价值? 如何真正将材料从惰性变成活性,从被动变成主动? 自然界具有各式各样、功能丰富的蛋白质,要在浩如烟海的蛋白质库中寻找合适的蛋白质,并运用到水凝胶的构建和功能化中,需要结构生物学和生物信息学的合作发展。全蛋白质水凝胶是一个可以以基因编码的方式去调控材料宏观性能的独特体系,为我们研究材料结构功能关系提供了强有力的手段。相信在未来几年内,全蛋白质水凝胶将会脱颖而出,成为生物材料中极具生命力和实际应用潜力的一个领域。

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