摘要：细菌生物膜导致的细菌耐药性增加受到了广泛关注。抗生物膜肽是一类具有抑制和杀灭细菌生物膜独特优势的抗微生物肽,有望成为理想的抗细菌生物膜的新型抗菌药物。就抗生物膜肽与生物膜各组分间的相互作用、抗生物膜肽对生物膜形成的干预作用及其调控、抗生物膜肽目前存在的问题及其解决思路以及抗生物膜肽未来的应用领域等展开综述。

1 抗生物膜肽与生物膜各组分间的相互作用

生物膜的胞外基质中包含大量蛋白质,包括菌毛、IV型菌毛以及多种由细菌分泌的酶（如蛋白酶）等。以铜绿假单胞菌为例,其菌毛和IV型菌毛具有多种生物学功能,并且通过多种动物研究证明了以鞭毛为靶抗原能够预防铜绿假单胞菌导致的感染。除此之外,IV型菌毛还能与生物膜中其他成分相互结合使得生物膜更加稳定[4]。Gowrishankar等[5]发现环二肽CLP能够使表皮葡萄球菌的生物膜多糖、蛋白质、eDNA显著降低,但具体机制尚不明确。Duperthuy 等[6]发现霍乱弧菌能增强OMVs蛋白表达来增强胞外基质中的Bap1蛋白。Bap1蛋白可以连接LL-37和OMVs表面的OmpT蛋白,使得生物膜内游离的LL-37浓度降低到有效浓度以下,使得生物膜细菌免受LL-37的作用。多种细胞外酶既是生物膜的组成成分,也是细菌的毒力因子组成成分之一。Akeel等[7]发现富含丙氨酸的抗生物膜肽PT13能够减少金黄色葡萄球菌毒力因子的产生。而其他具有杀灭生物膜细菌作用的抗生物膜肽也能通过杀灭细菌的方式减少毒力因子的产生。

生物膜中的多糖结构可以是单糖或者是大分子聚合物,主要用于维持生物膜的骨架结构。多糖还可以通过物理或化学截留抗生素穿透、抑制中性粒细胞的趋化作用、抑制抗微生物肽活性、以及清除活性氧,有助于细菌在严苛的环境中生存[8]。

不同的致病菌产生的胞外多糖也有差异。大多数的致病菌产生阴离子胞外多糖,如铜绿假单胞菌的藻多糖（Alg）,少数致病菌也会产生阳离子胞外多糖,如表皮葡萄球菌的细胞间多糖黏附素（PIA）。此外,同种细菌产生的胞外多糖也可能有差异。例如,肺炎克雷伯菌KpTs101产生中性胞外多糖,而KpTs113产生阴离子胞外多糖[9]。一些抗生物膜肽能够直接渗透进入生物膜内或导致胞外多糖断裂。如Pulido等[10]合成设计了RNase3氮端衍生肽,并通过研究证实了活性位点缺陷突变体具有与亲本蛋白相同的抗生物膜活性,并且具有比亲本蛋白更加优越的EPS穿透性。另外,破坏胞外多糖结构也是抗生物膜肽作用的另一方面,在EPS与环二肽CLP相互作用后发现,CLP能使表皮葡萄球菌EPS脱水,并使糖基乙酰化阻止α糖苷键连接[5]。值得注意的是,胞外多糖与抗生物膜肽间的静电相互作用会导致生物膜内细菌对于抗生物膜肽的抵抗性增强。如阳离子抗微生物肽LL-37和hBD3与PIA的静电排斥作用能够减少其与细菌接触[11]。而KpTs113带负电荷的胞外多糖能促使阳离子抗生物膜肽BMAP-27由线型螺旋化,并且KpTs101中性胞外多糖表现出更强的诱导抗生物膜肽螺旋化的能力[9]。

细胞外DNA（eDNA）是细菌主动释放、分泌或是在细菌溶解后释放在胞外基质中的DNA,在细菌活动中起着十分重要的作用。（1）构成生物膜：是维持生物膜细菌黏附、聚积和生物膜稳定性的重要组成成分[12];（2）营养作用：可以作为大肠杆菌唯一的磷、氮和碳的营养来源[13];（3）螯合作用：可以螯合金属离子（如Mg2+）及抗生素（如氨基糖苷类药物）[14];（4）降低pH;eDNA在生物膜中的累积会使生物膜局部环境酸化,酸性pH值会促进铜绿假单胞菌的耐药表型产生[12]。一些抗微生物肽能够导致生物膜中eDNA含量下降或者直接与之结合,使得eDNA无法发挥其功能。Wang等[15]发现乳酸链球菌肽（nisin）在高浓度条件下能够减少生物膜中eDNA的含量,且呈浓度依赖性变化。Jones等[14]发现人源抗微生物肽（hBD-3）能够直接与eDNA结合,但同时破坏了抗微生物肽hBD-3的生物活性。不能忽视的是,Lewenza等[16]报道了eDNA结合金属阳离子（如Mg2+）后,能够激活PhoPQ和PmrAB双组分系统。导致细菌表面结构发生变化、负电荷被掩盖（表型结构特化细菌）,使得阳离子抗生物膜肽正电荷无法作用于细胞膜。

生物膜是一个具有“蘑菇样”或“飘带样”的3D结构实体,里面的生物膜细菌也各司其职[4]。部分是负责生物膜的累积并不断分泌EPS的生物膜建设者,其与浮游态细菌并无两样。另一部分是如前文所述经历了细胞表面表型变化的表型结构特化细菌,能够产生高度的抗生素耐药。最后是一些底层生物膜细菌,由于其不断的受到低营养、低氧、低pH的极端环境挑战[17],因此一些细菌为了生存由此转入了一种“低代谢活动状态”甚至是“休眠状态”。使其对一些作用于基因复制位点、mRNA、核糖体等代谢活动相关抗生素高度耐药,并且该生物膜细菌是在不经历基因遗传变化的情况下产生对抗生素的耐药[18]。

随着生物膜试验研究不断深入,一些能够针对不同阶段生物膜细菌的抗生物膜肽相继被发现。LL-37是研究最广泛的人源抗生物膜肽,LL-37自身及其片段、衍生物都被证实具有抗生物膜活性（包括抑制生物膜形成和破坏成熟生物膜）并能杀灭生物膜细菌[19]。De Brucker等[20]发现了鼠源抗生物膜肽CRAMP在亚抑菌浓度下,能够抑制白色念珠菌生物膜的形成。Chen等[21]发现鸡源抗生物膜肽Cath-2能够穿透铜绿假单胞菌成熟生物膜并杀灭生物膜细菌,而CRAMP对整个生物膜有明显的清除作用。Mwangi等[22]发现抗生物膜肽ZY4能够杀灭鲍曼不动杆菌生物膜中的持留菌。Paulone等[23]发现了一种合成抗生物膜肽KP,能够通过抑制生物膜细菌生物膜形成相关基因的表达来破坏白色念珠菌成熟生物膜。

2 抗生物膜肽对生物膜形成的干预作用及其调控

生物膜的形成是一个连续、动态的过程,主要分为黏附阶段、形成阶段、成熟阶段和释放阶段[24]。其形成的具体过程常常受到基因调控与环境的共同作用。

致病菌形成生物膜的一个很重要环节就是细菌必须黏附于一个生物或者非生物表面。当细菌未黏附时甚至黏附不牢固时生物膜形成时间和质量都会受到影响。因此,利用抗微生物肽改变细菌的黏附能力或黏附的材料表面就能够减少生物膜的形成。Scarsini等[25]利用抗生物膜肽LL-37减少了念珠菌对聚苯乙烯和硅酮表面的黏附从而阻止了念珠菌生物膜的形成。还有一些抗生物膜肽涂层研究将在本文应用及展望中描述。

通过直接调控生物膜组分基因的表达也能影响生物膜的形成过程。Yu等[26]发现抗生物膜肽MC1可以通过下调铜绿假单胞菌pelA、AlgD和PslA基因的相对表达量减少胞外多糖合成来抑制生物膜的形成。Akeel等[7]发现富含丙氨酸的抗生物膜肽PT13能够抑制细菌黏附和细菌黏附蛋白编码基因、减少EPS的产生,抑制生物膜的形成。

密度感应（Quorum sensing,QS）系统存在于多种细菌之中,调控着细菌多种毒力因子及生物膜的形成相关基因[27]。铜绿假单胞菌的QS系统主要由2组高丝氨酸（AHL）驱动LasI/R和RhlI/R系统、2组非AHL驱动的PQS和IQS系统组成,与生物膜相关的多为前者[27]。Taha等[28]合成了2种抗生物膜肽,结果显示,其能减少铜绿假单胞菌PAO1生物膜的形成和毒力因子产生,并通过荧光定量PCR测定QS相关基因变化,并发现lasI、lasR、rhlI和rhlR的基因表达水平显著降低。Ciulla等[29]报道了金黄色葡萄球菌的生物膜QS系统是由RNAIII活性肽（RAP）及其靶蛋白（TRAP）介导的,RNAIII抑制肽（RIP）能够与RAP竞争从而抑制TRAP的磷酸化,来减少细菌黏附和生物膜形成。但此类抗生物膜肽并不具有杀菌活性,因此可作为药物的增效剂。优势是直接作用于生物膜的形成,可以恢复抗生素和免疫系统对生物膜细菌的杀伤活性。

3,5-环二聚鸟苷单磷酸（c-di-GMP）是广泛存在于细菌内的第二信使,与多种生物学过程相关,同时也与生物膜的形成直接相关。c-di-GMP含量增加可以促进细菌表面黏附、聚集和EPS的分泌来诱导生物膜形成,降低则导致生物膜分散,因此可以通过减少细胞内的c-di-GMP水平来促进已经形成的生物膜分解扩散[30]。这一现象的机制可能与藻多糖的形成过程相关,Whitney等[31]证实了Alg44具有一个具有二聚模式的PilZ折叠区域,能够与c-di-GMP结合,控制藻酸盐的分泌。随后Foletti等[32]发现富含脯氨酸的四肽Gup-Gup-Nap-Arg在水中结合c-di-GMP比其他核苷酸拥有更高的选择性,并且能抑制铜绿假单胞菌生物膜的生长。这一现象为抗生物膜肽的结构优化提供了参考。

3 抗生物膜肽目前存在的问题及解决思路

由于抗生物膜肽具有抑制生物膜形成或清除已经成熟的生物膜的特点,越来越多的研究者认为,它是是防治细菌生物膜感染的潜在新型药物,但目前其自身还存在诸多缺陷使其很难应用于临床。

天然多肽在体内很容易被蛋白酶水解以及血浆半衰期短。因此,如何提高抗生物膜肽在体内的稳定性至关重要。抗微生物肽结构修饰是重要的一步,目前可以通过将直链肽环化、将L-型氨基酸更换为D-型氨基酸、改变多肽链中单个或者多个氨基酸、改变多肽链的亲/疏水性、利用药剂学方法将多肽进行包被等手段可提高抗生物膜肽的稳定性和延长血浆半衰期[33]。

抗生物膜肽往往容易对真核细胞表现出一定的溶血性或细胞毒性。为此,如何对抗生物膜肽进行修饰显得至关重要。一方面是降低原有肽的细胞毒性,如Kang等[34]通过对Pseudin-2进行一系列修饰,通过取代色氨酸和丝氨酸来增加疏水性,获得的Pse-Anal6和Pse-Anal7可以显著减少细胞毒性和溶血性。此外,其被赖氨酸取代类似物的截断物Pse-T3和Pse-T4也能减少细胞毒性和溶血性。另一方面是在较低细胞毒性的基础上,增加抗生物膜肽的抗生物膜性能,如Yu等[35]对SPLUNC1-α4螺旋结构域增加阳离子数量和色氨酸的含量合成SPLUNC1-α4M1,这一改变显著增加了肽的抗生物膜能力,但并没有增加肽的溶血性和细胞毒性。除此之外,Kłodzińska等[36]利用改性透明质酸组成的纳米凝胶包被抗生物膜肽DJK-5后,纳米凝胶中的DJK-5比未包被的肽的毒性降低了4倍,而不影响肽的抗菌性能。说明通过新型药剂学的手段也可以降低抗生物膜肽的毒副作用。

抗微生物肽虽然种类繁多,但是来源却十分有限。研究表明外源性添加活性成分可以上调机体内源性抗生物膜肽的表达[37],但是分离纯化难度大、产率低,难以直接满足使用需要。虽然化学合成的方法可以解决抗生物膜肽产量低的问题,但生产成本高。利用基因工程的方法来表达抗生物膜肽似乎是个不错的选择。目前,抗微生物肽主要的表达系统包括原核表达系统（大肠杆菌表达系统、病毒表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统）、真核表达系统和动植物表达系统等,但仍然存在在表达过程中对蛋白酶较为敏感,回收率低导致成本高等问题。可以通过修饰增强酶稳定性,提高基因转导准确性,采取适当工艺提高产品回收率等办法,最终提高抗生物膜肽的生产效率、降低成本,真正实现规模化和产业化[38]。

由于抗生物膜肽自身的不足、生产成本昂贵以及专门针对生物膜的药物开发周期较长等缺陷。因此,在现有抗生素的基础上开展与抗生物膜肽的联合用药具有重大意义。Dosler等[39]通过研究3种抗生物膜肽和5种抗生素联合用药,提出抗生物膜肽与抗生素联合使用有助于预防或者延缓耐药性的出现。随后Dosler等[40]又发现抗生物膜肽即使在1/10MIC浓度条件下,也能显著增强抗生素的杀菌活性,甚至某些抗生素的最小生物膜根除浓度（MBEC）降低了8倍。Lashua等[41]报道了WLBU2阳离子抗菌肽,与妥布霉素、环丙沙星、头孢他啶、美罗培南联用时显著增强了抗生素对生物膜细菌的杀伤活性。但其具体机制尚不明确,推测如下：（1）抗生物膜肽增加了EPS的通透性。如Martinez等[42]利用共聚焦激光扫描显微镜发现,P5抗生物膜肽可以破坏铜绿假单胞菌生物膜原有结构。若此时联合本身具有抑杀该类细菌活性的抗生素,可使其在生物膜内局部浓度升高而起到协同作用;（2）抗生物膜肽恢复生物膜细菌代谢活性。生物膜细菌常常处于活性较低甚至是可逆的休眠状态,而通常抗生素对低代谢活性的细菌作用较弱,从而导致高度的抗生素耐药[18],抗生物膜肽可能促使生物膜细菌由休眠态重新复苏,联合用药之后可使生物膜细菌对抗生素更加敏感;（3）抗生物膜肽影响生物膜成熟程度,有利于抗生素发挥杀菌作用。如前文所述,某些抗生物膜肽直接参与生物膜形成的调控过程,虽本身并不具有杀菌活性,但可降低生物膜的高度结构化,联合使用抗生素后更有利于后者发挥杀菌作用。

4 应用及展望

随着由生物膜引起的致病菌耐药性不断加剧,抗生物膜肽由于其种类丰富、作用机制独特及不易产生耐药性的特点而受到广泛的关注。近年来已有一些抗微生物肽被应用于临床实践。例如,由Xoma公司合成的Neuprex被应用于脑膜炎双球菌血症患儿。EntoMed SA 公司合成的Thanatin 衍生肽被应用于免疫低下患者全身性真菌感染和多重耐药菌感染。Micrologix 生物技术公司合成的MBI-肽被应用于尿道相关的血流感染、鼻腔感染。Demgen和Dow制药公司合成的Histatin 衍生肽被应用于牙跟炎、口腔感染和口腔念珠菌感染[37]。

未来将不断探索和拓展抗生物膜肽的种类和功能。抗生物膜肽将会以多种形式应用于生活中的各个领域,由细菌生物膜引起的感染和困扰将被逐一解决。

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