摘 要: 生物活性肽是一类对生物机体有益且易被机体吸收的小分子聚合物, 是由 2~20 个氨基酸组成的蛋白质片段, 其功能性质由氨基酸组成和排列顺序决定。植物是生物活性肽的天然宝库, 植物源生物活性肽种类丰富、结构新颖, 是近年来的研究热点。生物活性肽被视为营养保健品和功能食品成分, 除了含有丰富的营养价值之外, 还具有抗氧化、降血压、抑菌、降血脂和维持血糖水平平衡等功能, 可利用其功能治疗、控制和预防慢性疾病, 对食品、医药和美容等领域的发展具有重要意义。本文综述了近 5 年从植物中获取生物活性肽的最新进展, 系统地总结了抗氧化肽、降压肽、抗菌肽、降血糖肽和降血脂肽的作用机制, 与目前最常见的健康问题进行对应说明。对生物活性肽的制备方法、分离纯化和鉴定技术进行总结比较, 并对生物活性肽的未来发展趋势以及在实际应用中遇到的问题进行展望, 为未来植物源生物活性肽的进一步研究开发与应用提供参考。

近年来, 由于饮食不均衡、作息不规律和生活压力过大等种种因素引起的如高血脂、高血压和高血糖等一系列健康问题日趋严重, 寻求一种天然来源、效果明显且对人体健康无不良作用的治疗药物已经迫在眉睫。生物活性肽是从蛋白质中释放出来的, 其功能活性取决于氨基酸的组成及排列顺序, 能够满足人体健康的不同需求, 具有无副作用且易被人体吸收的优点[1]。植物作为生物活性肽的一种宝贵来源, 与动物相比, 植物资源更丰富、高度可再生且成本更低, 从植物中获取生物活性肽将会成为一种发展趋势[2‒3]。特别是近年来, 植物活性肽的许多优异功能被发掘, 例如抗氧化、抗癌、降血压、抑菌、改善记忆力、降血脂和维持体内血糖平衡等, 正基于此优异品质, 生物活性肽在医药行业具有优良的应用前景, 世界各国研究学者欲开发功能肽作为人工合成药物的理想替代品[4]。不仅如此, 除了治疗作用之外, 还能预防或降低一些疾病的发生风险[5]。目前, 关于生物活性肽的综述专注于一种功能的肽类或者是一种作物中发现的活性肽, 还未系统地介绍不同植物源的功能肽及制备分离技术。本文从植物源出发, 系统地总结了生物活性肽的功能、制备、分离纯化和鉴定技术, 以期为后续活性肽的深入研究及应用开发提供参考。

1 生物活性肽的概述

生物活性肽是蛋白质水解的中间产物, 是一种特定的蛋白质片段, 是由 2~20 个氨基酸组成的序列, 其分子量小于 10 kDa[6‒7]。由于生物活性肽是一类小分子化合物, 消化后的生物活性肽能够被肠道直接吸收, 从而增加其在生物体内的利用度。植物源生物活性肽按照其发挥的功能划分可分为抗氧化肽、降血压肽、抗菌肽、降血糖肽、降血脂肽、抗癌肽和抗炎肽等。

2 常见的几种植物源生物活性肽

机体在代谢过程中会有自由基产生, 当自由基的过度产生或者自由基得不到及时清除时会导致机体内氧化和抗氧化防御机制失衡, 从而引发机体组织的氧化损伤和细胞凋亡。自由基的增加不仅仅会加快机体的衰老速度, 甚至还会引发一系列严重的健康问题(如癌症、神经退行性疾病和心脑血管疾病等)[8]。迄今为止, 解决这些因自由基过多引起的健康问题的方法大多都是使用药物进行干预治疗, 而利用生物活性肽的功能进行干预或许是一个不错的选择。

从植物中获取的抗氧化肽能够最大程度地减少自由基对细胞的损伤和对机体的伤害, 是一种对人体有益的功能性化合物。蛋白酶通过水解蛋白质特定的肽键达到释放活性的目的, 而蛋白酶种类的选择与蛋白水解物的抗氧化活性密切相关, ZAKY 等[9]从米糠蛋白的研究中发现用复合蛋白酶水解米糠蛋白的水解度最高达到 20.25%, 通过对米糠蛋白水解产物进行 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)自由基清除实验、2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐[2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ammonium salt, ABTS]自由基抑制实验和金属螯合活性的测定发现用风味蛋白酶水解米糠蛋白所释放出来的肽的抗氧化活性最强。WALI 等[10]用 4 种不同的蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶)对鹰嘴豆芽蛋白进行处理, 发现经中性蛋白酶处理得到的肽具有更高的抗氧化活性。这说明蛋白酶的专一性决定了蛋白质的酶切位点, 当蛋白质被不同的蛋白酶水解特定的肽键后暴露出的不同的疏水氨基酸决定了其抗氧化活性的强弱。

蛋白质在酶水解的过程中会产生不同分子量大小的肽, 分子量大小与抗氧化活性的强弱有关。低分子量肽(<3 kDa)的抗氧化能力总是高于高分子量肽, 这可能是因为低分子量的抗氧化肽能够更有效地与自由基发生反应, 且更容易被人体所吸收[11]。MESHGINFAR 等[12]用碱性蛋白酶水解番茄种子蛋白, 并用超滤的方法将番茄种子蛋白水解物分离成不同分子量大小的肽组分。其中分子量小于3 kDa 的肽组分的抗氧化活性(73.15% DPPH 清除率和 60.1%磷钼酸铵还原能力)要高于其他较大分子量组分(>3 kDa)的抗氧化活性。SUN 等[13]采用离子交换色谱、凝胶过滤色谱和半制备反相高效液相色谱法对桑叶蛋白水解物进行分离纯化, 发现分子量为 0.45~1.40 kDa 的寡肽的 DPPH 和 ABTS自由基清除活性最强(分别为 87%和 33%), 证明了桑叶蛋白水解产物的抗氧化活性与分子量的分布有关, 并且发现较低分子量肽(<1 kDa)是最有效的抗氧化剂。不仅如此, 蛋白质在酶水解之前对蛋白质底物进行预处理也能够改善和提高生物活性肽的生物活性[14]。蛋白质预处理最常见的方法有超声预处理、脉冲电场、微波和高压等, 将蛋白质底物用超声波预处理后再进行酶解不仅可以提高蛋白质的水解度, 还可以加快蛋白质的酶解速度[15]。这可能是因为超声波会对蛋白质的结构产生影响, 使酶解反应过程中酶和底物能够更有效地发生碰撞, 从而达到所需要的预期效果, 提高生物利用度[16]。由此可看出抗氧化活性与人体健康密切相关, 利用生物活性肽的抗氧化功能可以降低许多疾病的患病风险, 将抗氧化活性应用于功能食品这一领域将会有很好的发展前景。

高血压是世界范围内的一个重大的健康问题, 特别是近些年来, 人们面对的压力增大、饮食和作息不规律, 高血压等问题也接踵而来。一些治疗高血压的药物虽然能够维持人体的血压处于一个正常水平, 但长期服用也会对健康带来一定的影响, 而从植物中获取降压功能的生物活性肽可以作为市售降压药物的理想替代品, 其生物学机制主要是抑制血管紧张素转换酶 (angiotensin-converting enzyme, ACE), 从而通过肾素-血管紧张素系统来调节体内血管收缩压和舒张压[17]。

植物蛋白水解物中 ACE 的抑制活性是治疗高血压的关键, 这是因为 ACE 是治疗高血压的重要靶点, 肽的 ACE抑制活性取决于 N 或 C 末端氨基酸残基对 ACE 活性位点的亲和力, 而低分子量肽更容易与 ACE 活性位点相结合。因此, 较低分子量肽(<3 kDa)可以作为 ACE 活性的优选抑制剂[18‒19]。AONDONA 等[20]用超滤的方法将芝麻蛋白水解物分成不同分子量大小的组分进行分析, 发现低分子量芝麻肽(<1 kDa)具有很好的 ACE 抑制能力(81%), 而较大分子量肽 (3~10 kDa) 表现出更强的肾素抑制特性(75%~85%)。ZHENG 等[21]用凝胶色谱法、反相高效液相色谱法纯化的裸燕麦球蛋白水解产物中鉴定出了一种新的ACE抑制肽 SSYYPFK (890.4 Da), 并且通过动物体内实验证明了这种 ACE 抑制肽可以降低自发性高血压大鼠的收缩压和舒张压。SONKLIN 等[22]用菠萝蛋白酶水解脱脂绿豆粕, 用超滤的方法将绿豆粕蛋白水解物分离成不同的肽组分, 其中分子量<1 kDa 的肽组分是最活跃的 ACE 和肾素抑制剂, 并且从小于 1 kDa 的肽组分中鉴定出了 5 种肽(LPRL、YADLVE、LRLESF、HLNVVHEN、PGSGCAGTDL)具有降压作用, 其中 LRLESF 是最有效的 ACE 抑制剂[半数抑制浓度(median inhibition concentration, IC50)为 5.4 µmol/L]。由于 YADLVE 在 N 末端有酪氨酸、C 末端有谷氨酸, 因此被认为是最强的肾素抑制剂, 其抑制率高达 97%。通过对自发性高血压大鼠口服给药后, 血压显著降低。这表明低分子量肽(<3 kDa)相对于高分子量肽(>3 kDa)显示出更优异的 ACE 抑制能力, 具有更好的降压效果。

肽的降压活性还与蛋白酶的种类有关。不同蛋白酶的酶切位点不同, 制备所得到的肽的结构会有所差异, 从而导致肽的降压活性不一致。碱性蛋白酶是一种丝氨酸酶, 偏向于形成末端带有疏水氨基酸的肽, 胰蛋白酶更倾向于切割与芳香氨基酸或者是不带电的支链氨基酸残基结合的肽键, 而胃蛋白酶更偏爱裂解疏水性和芳香族残基[23]。因此, 暴露的疏水氨基酸可以显著提高多肽的 ACE 活性。SHU 等[24]用 3 种不同的商业酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶)对腰果蛋白进行水解并分析分子量小于 3500 Da多肽的 ACE 活性, 发现碱性蛋白酶的水解产物比其他两种酶的水解产物的 ACE 抑制活性高, 并通过体内实验证明了腰果肽可以在小鼠体内发挥降压作用。PABLO‐ OSORIO 等[25]用 4 种不同的蛋白酶(碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和 α 糜蛋白酶)对奇亚籽蛋白进行处理, 发现胃蛋白酶水解物 ACE 抑制活性最强(IC50=0.128 mg/mL)。

服用降压药无疑是目前降低血压最高效的方法, 但长期使用高血压药物进行治疗显示出对人体较大的伤害, 尤其是高血压患者的年轻化因为药物的副作用产生了抗拒心理[26]。此时, 肽无副毒作用的优势尽然发挥, 肽不仅可以作为一种治疗手段成为制药行业的新宠, 还可以通过功能食品的渠道进行身体的内部调节, 从而达到人体血压的平衡。

耐药菌株的出现是对人类健康的最大挑战, 为寻求新的有效抗菌药物来保护公众健康敲响了警钟。人们迫切需要找到抗菌肽等替代品解决抗生素危机[27‒28]。而抗菌肽正是人们目前找到的最理想的抗生素替代物, 并且越来越多的抗菌肽资源被发现并被深入研究。抗菌肽分为 3 种类型: 抗菌、抗真菌以及抗病毒化合物。抗菌肽能够破坏病原菌的细胞膜, 破坏其结构完整性从而导致细菌死亡[29]。天然抗菌肽拥有与传统抗生素同样的杀菌能力, 并且抗菌肽具有明显的优势, 不仅能够有效地调节宿主免疫反应的能力, 而且不易出现细菌耐药性, 是目前最有发展前途的广谱抗生素候选药物之一[30]。近些年对于抗菌肽的研究已经取得了重大进展, GARZON 等[31]从高粱废谷物蛋白水解物中分离出了加密在高粱蛋白中的抗菌肽, 并且通过最小浓度抑制方法评估了其抗菌活性。KONG 等[32]运用离子交换色谱和反相高效液相色谱结合的方法对棉籽蛋白酶解物进行纯化, 并且从纯化的棉籽蛋白酶解物中鉴定出了 3 种新型抗菌肽(HHRRFSLY、KFMPT 和 RRLFSDY)。这些抗菌肽能够破坏大肠杆菌的细胞膜, 从而达到抑菌效果。通过分子对接发现这 3 种抗菌肽能够通过氢键和盐桥与表面蛋白的活性位点相结合, 进而达到杀菌作用。HEYMICH等[33]从鹰嘴豆贮藏蛋白酶解物中鉴定出了 21 种抗菌肽, 对病原菌、腐败细菌以及 2 种耐药菌株均具有抗菌活性, 其最低抑菌浓度为 15.6 μmol/L, 与传统的食品防腐剂相比, 抗菌肽的抗菌活性更高。从植物蛋白中分离出来的抗菌肽含有疏水性氨基酸, 而肽的疏水性会导致细菌细胞壁和细胞膜的功能紊乱, 以致细菌细胞壁的破坏, 从而达到抑菌效果。

目前, 用于治疗的抗生素药物种类十分有限, 随着抗生素耐药性危机的出现, 促使人们寻找新的药物解决无药可医的危险境地。肽就是这样一种新型抗生素替代物的代表, 抗菌肽的发现为解决抗生素危机提供了方向, 对未来抗菌肽的开发利用奠定了一定基础。

糖尿病是一种慢性代谢性疾病, 最典型的特性为体内血糖失调, 糖尿病患者往往会增加其他相关疾病的患病风险。近几年来, 糖尿病的患病率正在以惊人的速度上涨, 治疗糖尿病并预防其并发症一直是一个棘手的问题, 而抗糖尿病功能肽的发现很好地解决了这一问题[34]。抗糖尿病肽是通过抑制 α 淀粉酶、α 葡萄糖苷酶和二肽基肽酶Ⅳ (dipeptidyl peptidase-Ⅳ, DPP-Ⅳ)发挥作用的, 能够有效地降低血清葡萄糖水平, 从而达到治疗糖尿病的目的[35]。有些研究已经证明了蛋白质水解物中含有抗糖尿病活性的肽 , 从燕麦球蛋白中获取的燕麦肽能够有效地抑制Caco-2 细胞中 DPP-Ⅳ的活性, 对 α 葡萄糖苷酶也有一定的抑制作用[36]。WANG 等[37]通过体外细胞实验和体内实验研究了核桃蛋白水解肽的抗糖尿病活性, 核桃蛋白水解物通过超滤的方法分离出3种不同分子量大小的多肽组分, 发现中等分子量(3~10 kDa)的核桃水解肽表现出最高的 α-葡萄糖苷酶抑制率(61.73%), 能够有效地降低血糖水平。KARIMI 等[38]发现玉米胚芽蛋白水解物的抗糖尿病潜力与蛋白酶的种类有关, 研究表明风味蛋白酶水解物(<2 kDa)对α-葡萄糖苷酶抑制效果最佳(41.3%), 碱性蛋白酶水解物(2~10 kDa)表现出最强的 α-淀粉酶抑制活性(71.3%)和最强的 DPP-Ⅳ的抑制活性(45.9%)。

抗糖尿病功能肽能维持机体血糖水平处于相对平衡状态, 对机体的调节机制发挥着重要作用。由于水解过程产生的不是单一肽, 而是混合肽类化合物, 还需要经过一系列的分离纯化才能得到抗糖尿病肽, 当其作为一种治疗药物被研发时, 需要进一步进行人体临床验证。

随着生活水平的提高以及生活节奏的加快, 人们在久坐不动并且缺乏运动的同时摄入一些高胆固醇的食物会导致体内血脂水平升高, 长期的高脂饮食不仅会导致肥胖还会引起血脂异常以及一系列代谢紊乱的并发症。目前市面上降血脂的药物种类繁多, 治疗效果明显, 但不足之处是这些药物价格不仅昂贵还会有一定的副作用。降血脂的作用途径主要是通过调节胆固醇代谢和甘油三酯水平[39]。YANG 等[40]发现在碱性蛋白酶 2.4 L、pH 7.9、水解温度62.4℃、酶含量 6.98%、底物浓度 4.13%、水解时间 4.23 h的条件下得到的核桃粕肽能够改善长期高脂饮食大鼠的脂质代谢, 对肝脏也有一定的保护作用。AJAYI 等[41]发现用菠萝蛋白酶产生的苋菜蛋白水解物鉴定出了 3 个具有胰脂肪酶抑制活性的肽(FPFPPTLGY、 FGAPR 和FPFVPAPT), 其中 FPFVPAPT 对胆固醇酯酶具有抑制活性, 能够加快胆固醇代谢从而有效降低血液中胆固醇水平, 并且能够有效地预防和治疗动脉硬化。

血脂过高容易引起血管堵塞, 是患者中风的原因之一, 危险性极高且患病后的后遗症明显, 目前对于高血脂患者的治疗方案大多是长期服用阿托伐他汀类药物降低血液粘稠度[42]。降血脂肽的研究可以从根源对此类疾病进行预防, 在功能食品的开发中占有巨大优势。

除了上述功能活性外, 生物活性肽还有改善人体记忆力、抗炎、免疫调节和抗癌等功能。从植物中获取的生物活性肽往往是多种功能并存。REN 等[43]发现了核桃水解肽(<3 kDa)具有较强的抗氧化作用, 对过氧化氢诱导的PC12 细胞凋亡有较强的神经保护作用, 并且在动物实验中发现核桃肽能够改善小鼠记忆力和学习障碍。在小米的研究中也验证了肽类可以具有多种活性, 小米蛋白水解物对胰脂肪酶有抑制作用和抗炎作用, 并发现抗炎肽中甘氨酸的含量最高[44]。XU 等[45]从大米蛋白水解物中分离纯化出了具有免疫调节作用的六肽(YGIYPR), 在 12.5~100.0 μg/mL 的范围内能够增强巨噬细胞 RAW264.7 的增殖, 即使在最小的剂量下也能达到很好的增殖效果。CHEN 等[46]从黑豆蛋白水解物中分离出具有抗氧化和抗癌活性肽, 分子量小于4 kDa 的黑豆肽具有最高的 DPPH 自由基清除活性和羟基自由基清除活性(IC50=96.19、30.53 μg/mL), 对人肝(human hepatoellular carcinomas, HepG2)、肺(macrophage chemotactic factor-7, MCF-7)、宫颈(helen lane, Hela)癌细胞的生长具有抑制作用。多功能肽用于医学既能够解决某些疾病问题, 又能预防和减少并发症的发生机率, 这一发现对医学的发展起到了一定的推动作用。

3 植物源生物活性肽的制备、分离纯化与鉴定

获取生物活性肽最常用的方法是酶解法, 与微生物发酵法相比, 蛋白酶水解时间短且更易控制水解条件, 但肽的生物活性与提取条件密切相关。PEI 等[47]用酶解法从青稞中提取抗菌肽, 研究了胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶对青稞水解物抗菌活性的影响, 发现青稞用胰蛋白酶酶解 4 h 后, 肽的抗菌活性达到最高值, 并且利用磁性脂质体吸附技术纯化出了一种新型的抗菌肽(大麦素), 而大肠杆菌对大麦素十分敏感。TOK等[48]在对大麦籽粒的研究中发现了胰蛋白酶水解物具有多种功能活性(抗氧化、抗糖尿病和抗菌)。LIU 等[49]采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶两步酶解法水解松仁蛋白, 发现松仁肽具有清除自由基的能力, 并且发现 200 μg/mL 的松仁蛋白水解物作用于 HepG2 细胞时, 其活力为 97.38%, 证明松仁肽对细胞没有毒性且不会对细胞有抑制作用。不仅如此, 松仁蛋白水解物还能降低 D-半乳糖致衰老小鼠血清、心脏和肝脏中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量, 提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性。酶解法是获取肽类化合物最温和的方法, 所获得的酶解产物往往具有多种活性, 因此也是目前获取肽的最常用方法。

微生物菌种在自身生产代谢过程中会有蛋白酶的产生, 而这些蛋白酶会对蛋白质起到降解作用, 使蛋白质降解为分子量更小的肽段或氨基酸。微生物发酵法相对于酶解法而言, 其最大优势在于以低成本获取高活性高产量的肽。WEI 等[50]发现豆腐乳在微生物发酵过程中产生抗氧化肽和 ACE 抑制肽, 并且发现发酵时间与肽的生物活性有关, 其生物活性随着发酵而显著增加。SHARMA 等[51]利用植物乳杆菌 NCDC374 处理亚麻籽乳制备功能肽并进行发酵工艺优化, 以接种量和发酵时间为影响因素, 蛋白水解率、抗氧化活性和 ACE 抑制率为响应值得到最佳工艺。当接种量为 4.2%, 发酵时间为 126 h 时, ACE 抑制率和 DPPH抑制活性达到最大(41.35%、67.38%)。发酵往往需要的时间较长, 而过长的时间可能会带来一些安全隐患(如污染), 这也是微生物发酵法未来需要解决的问题。

肽的合成方法主要包括化学合成法和基因重组法。化学合成法主要应用于已知肽链的合成, 通过氨基酸的缩合来实现。化学合成法能够通过改变氨基酸的种类和排列顺序改善肽的性质, 因此, 合成肽往往具有更高的生物利用度[52]。基因重组法是将基因整合到宿主中进行克隆表达以获取重组多肽, 解决了传统制备方法的局限性, 但表达过程中会受到表达系统的影响[53]。化学合成法和基因重组法都是对已知序列的肽链进行合成, 开发周期较长, 且提取成本相对较高。因此, 合成法并没有被普遍应用于肽的制备[54]。针对于活性肽在不同领域的应用, 制备方法的选择十分重要, 生物活性肽的常见制备方法整理见表 1。

蛋白质酶解产物中含有未被水解的蛋白质、未完全水解产生的多肽以及完全水解产生的游离氨基酸。为了能够更加清楚地了解肽的活性、作用机制及其结构, 需要通过分离纯化以及鉴定完成。根据混合肽的物理性质和分子极性的差异进行分离, 可以采取不同的分离方法。在实验室中最常用的分离技术有超滤、凝胶过滤色谱、离子交换色谱、液相色谱和电泳等。在未来的研究中可以运用一些新技术去获取更高纯度和高活性的生物活性肽。

生物活性肽分离纯化的第一步往往是通过超滤实现。超滤是根据超滤膜的孔径不同对不同分子量大小的生物活性肽进行截留分离, 是一种物理分离方式, 优点是操作简单、经济实惠且不会对生物活性产生影响。但对于一些分子量大小相近的生物活性肽无法通过超滤膜进行分离, 因此超滤法只能用于生物活性肽的粗分离。XIA 等[58]使用超滤膜(3 kDa)将绿豆蛋白水解物分离成两个组分, 发现分子量小于 3 kDa 的肽组分抗氧化活性更强, 并从中鉴定出了8 个多肽, 其中 WGN、AW、RGWYE、GVPFW 不仅具有较高的抗氧化活性, 还对过氧化氢诱导的细胞毒性具有保护作用, 并且能够特异性调控 HepG2 细胞的 MDA 含量、过氧化氢酶(catalase, CAT)活性和总谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量。LI 等[59]使用 3 kDa 的超滤管对大孔树脂脱盐的黑豆蛋白肽进行粗分离并对其 ACE 抑制活性进行测定, 发现超滤后的组分 ACE 抑制活性增强, 超滤前黑豆蛋白水解物 ACE 抑制活性为 72.38%, 脱盐处理后 ACE 抑制活性为 74.45%, 而超滤处理后的黑豆肽(<3 kDa)能够抑制80.53%的 ACE 活性。超滤膜是一种快速分离的方式, 由于其滤孔容易被堵塞, 并且分离出来的产物纯度不够高, 一般还需要对超滤产物进一步纯化。

色谱法是分离纯化中应用最广泛的方法, 在肽的分离纯化中主要会用到凝胶过滤色谱、离子交换色谱、高效液相色谱以及反相高效液相色谱。

凝胶过滤色谱法是以分子筛的形式根据分子的大小差异进行分离。当肽溶液流过色谱柱时, 大分子会在孔隙外以相对较快速度先出来, 相反, 小分子会进入固定相基质孔隙中以较慢的速度后出来, 从而根据分子量大小达到分离效果。这种分离方式操作简单、条件温和、成本较低且无污染, 广泛应用于多肽的分离纯化。但其分离效果受到填充料种类、洗脱速度和色谱柱体积等因素的影响。YAO 等[60]使用 Sephadex G-25 凝胶过滤将质量浓度为 25 mg/mL 的油茶籽粕蛋白水解液(<1 kDa)以 1 mL/min 的洗脱速度进行洗脱, 分离出了 3 个组分的 ACE 抑制肽, 最高 ACE 抑制率达到 79.24%, IC50=0.678 mg/mL。在核桃蛋白水解物的研究中使用凝胶过滤、高效液相色谱和质谱技术纯化并鉴定出了 3 种 ACE 抑制肽, 其中 GVVPHN 是由 6 个氨基酸组成的纯化肽, 其抑制率最高[61]。

离子交换色谱是利用固定相和流动相中电荷间的相互作用, 使多肽所携带的电荷与离子交换剂中相反的电荷相结合达到分离目的。离子交换技术又分为阳离子交换色谱和阴离子交换色谱, 对于固定相的选择取决于流动相所携带的电荷为阴离子还是阳离子。KONG 等[62]使用 SP Sephadex C-25 葡聚糖凝胶柱纯化脱脂核桃粕蛋白水解物(<5 kDa), 用乙酸缓冲液(pH 4)平衡柱子, 用含有 2 mol/L NaCl 的 10 mmol/L 的乙酸溶液对分子量小于 5 kDa 的肽进行梯度洗脱, 收集到了两个级分的 DPP-Ⅳ抑制肽, 并发现含有碱性氨基酸残基的肽级分具有更高的 DPP-Ⅳ的抑制活性。MIJITI 等[63]用 C18 反相柱色谱和离子交换色谱从小茴香种子中分离出对细菌(大肠杆菌、金色葡萄球菌)和真菌(白色念珠菌)均具有抗菌作用的抗菌肽。

每一种分离方法都具有不同的特点, 选择合适的分离方式能够更好的分离混合物。单一的分离纯化技术对生物活性肽进行分离纯化效果可能不佳, 需要结合多种分离纯化技术的特性进行分离。纯化的效果对肽的功能活性也有一定的影响, 纯度越高其功能活性越强。

生物活性肽经过一系列的分离纯化后, 需要对所获得的肽序列进行鉴定和解析, 以了解肽的结构与其功能之间的联系。质谱鉴定法已经是一项十分成熟的技术, 常用的方法有液相色谱-串联质谱法、电喷雾电离质谱法等, 在多肽氨基酸序列鉴定中使用率最高的是高效液相色谱-串联质谱法, 此方法结合了色谱和质谱的优点(灵敏度高、分辨率高、适用范围广和鉴定速度快)。MA 等[66]用高效液相色谱-质谱法在辣木蛋白肽中鉴定出了两种 ACE 抑制活性较强的序列, 分别为 LGF 和 GLFF, 并且发现疏水性氨基酸是影响 ACE 抑制活性的关键因素。FAN 等[67]用电喷雾电离四极杆飞行时间质谱法从藜麦蛋白水解物中鉴定出了具有抗癌活性的肽(FHPFPR、NWFPLPR、HYNPYFPGGA), 对结合组蛋白去乙酰化酶 1 (histone deacetylase 1, HDAC1)具有较好的抑制活性, 能够抑制 Caco-2 细胞中 HDAC1 的表达, 从而达到抑制癌细胞增殖的目的。质谱技术在肽中的研究发挥了重要作用, 为进一步探究生物活性肽的作用机制提供了证据。

4 结束语

生物活性肽是一种十分有发展前途的小分子化合物, 其多种功能活性都对人体有健康益处。随着对生物活性肽研究的深入, 其多种功能被陆续发掘出来。目前对于生物活性肽的制备、分离纯化、结构鉴定和活性测定的方法已经十分完善。近几年对于生物活性肽的研究与开发涉及多个领域, 如在医药行业可以作为慢性疾病治疗药物的一种理想且安全高效的替代品, 也可以代替抗生素发挥作用, 解决目前遭遇的抗生素危机而导致无药可医的状况; 在食品行业可以研发出具有某种功能特性的保健品, 也可以作为天然来源的食品添加剂和食品保鲜剂; 在美容行业可作为抗衰老和美容护肤的天然产品。

植物源生物活性肽的来源十分广泛, 但目前研究的植物种类还远远不够, 例如, 山桐子等植物中生物活性肽的研究还未展开, 需要对更多的植物源进行探索和发掘其功能活性。此外, 生物活性肽的开发应用处于一个实验阶段, 还缺乏人体临床验证实验, 暂时无法以产品的形式进入商业化大生产, 在未来对生物活性肽的研究方面更应该着重于人体健康的构效关系, 早日为人类健康做出贡献。

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