摘 要: 目的 探究抗菌肽 cp1 对蜡样芽孢杆菌的抑菌作用, 并进一步分析抗菌肽 cp1 在巴氏杀菌乳中的应用。方法 以蜡样芽胞杆菌为研究对象, 通过测定抑菌圈直径(diameter of inhibition zone, DIZ)、最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)、最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)评价抗菌肽cp1 对蜡样芽胞杆菌的抑菌效果。通过分析生长曲线、细胞内三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)、膜电位、内容物渗出和细胞形态的变化, 来揭示可能的作用机制。在此基础上, 并探究抗菌肽 cp1 在巴氏杀菌乳贮藏中的应用。结果 当抗菌肽 cp1 质量浓度为 10 μg/mL 时, 其对蜡样芽胞杆菌的 DIZ 为(16.19±1.29) mm; 抗菌肽 cp1 对蜡样芽孢杆菌的 MIC、MBC 分别为 4 μg/mL 和 8 μg/mL; 当抗菌肽 cp1 质量浓度为 2 MIC 时, 蜡样芽胞杆菌几乎不生长; 抗菌肽 cp1 导致细胞内 ATP 含量降低, 细胞膜超极化, 细胞液(包括核酸和蛋白质)漏出, 细胞形态破坏; 在巴氏杀菌乳中添加 1 MIC 抗菌肽 cp1 对乳感官均无显著影响, 且 4℃条件下抗菌肽cp1 可有效抑制蜡样芽孢杆菌的生长, 将其保质期至少延长到 12 d。结论 抗菌肽 cp1 对蜡样芽孢杆菌具有较强的抑菌效果, 具有延长巴氏杀菌乳货架期的潜力。

巴氏杀菌乳因其灭菌温度低能更好地保留营养物质, 具有保健功能而受到世界各国的普遍关注[1]。然而, 在加工、生产和储存阶段容易受到微生物污染, 特别是蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。2022 年, 美国乳制品科学协会报道了因原料奶中细菌孢子在巴氏灭菌过程中并未杀灭, 导致了一半的液态奶变质[2]。ZHAO 等[3]从中国 500 份乳制品中分离出 54 株蜡样芽孢杆菌, 经调查发现婴幼儿配方奶粉占比 14%、原料奶占比 26%、巴氏杀菌奶占比 24%、超高温奶占比 16%、奶酪占比 20%。前人研究表明, 受蜡样芽胞杆菌污染的乳制品中产生了热不稳定的腹泻流变性毒素和热稳定的呕吐毒素, 这些毒素会引起腹泻和呕吐的综合症[4‒6]。同时, 蜡样芽胞杆菌分泌的蛋白酶和脂肪酶分解乳制品中营养物质, 导致食物腐败进而缩短货架期[7]。因此, 减少牛奶和相关产品被病原微生物尤其是蜡样芽胞杆菌污染, 是保障乳制品食品安全的迫切需要。

巴氏杀菌对芽孢菌的杀灭率低, 国内外研究发现在市售的巴氏杀菌乳中仍有未灭活的蜡样芽胞杆菌, 所产生的毒力因子威胁人类健康[8‒11]。目前, 奶制品普遍采用热杀菌技术, 但过高的温度会破坏牛奶中热敏性营养成分, 因此在温和杀菌方式下, 结合良好的生物防腐剂来延长牛奶货架期是液态奶加工新技术的重心[12]。相关研究表明, 抗菌肽因广谱抗菌性强、作用靶点准确、稳定性高且不易残留等特点, 被医药卫生行业和食品加工业等相关领域所关注[13]。其中, 乳酸链球菌素(nisin)作为一种典型的抗菌肽代表, 因其抑制腐败细菌和致病菌的效果突出, 且不会对产品物理化学特性造成显著的影响而被广泛应用于原料乳和巴氏杀菌乳中[14‒15]。抗菌肽可以预防多种致病菌感染, 目前已有大量报道表明抗菌肽对蜡样芽胞杆菌有明显的抑菌效果[16‒17]。LEE 等[18]在 1989 年首次从猪小肠的寄生虫中分离得到抗菌肽 cp1, 该肽的氨基酸序列为SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAQGGPR, 分子质量为3339 Da。李伦锋[19]研究发现抗菌肽 cp1 对食源性病原菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、沙门氏菌)均具有较强的抑菌效果, 且具有低毒性, 并应用于鲜牛奶保鲜中, 但并未对抑菌的作用机制进行研究。目前关于抗菌肽cp1 对蜡样芽孢杆菌的抑制作用鲜有报道。基于此, 本研究以蜡样芽孢杆菌为指示菌, 探讨抗菌肽 cp1 对其抑菌作用机制, 并研究抗菌肽 cp1 在巴氏杀菌乳中的实际抑菌效果, 为抗菌肽 cp1 在液态奶中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

营养肉汤(luria-bertani, LB)、琼脂(生物试剂, 青岛海博生物科技有限公司); 三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)含量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所); 双 1,3-二巴比妥酸-三次甲基氧烯洛尔[bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol, BiBAC4(3)](上海懋康生物科技有限公司); 二甲基亚砜(分析纯, 湖南九典化工科技有限公司); 无菌磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline, PBS, 北京索莱宝科技有限公司); 考马斯亮蓝 R250(分析纯, 伊默克化工有限公司); 戊二醛(分析纯, 安徽金粤冠新材料科技有限公司); 无水乙醇(分析纯, 南通恒轩化工有限公司)。

BKQ-B50II 高压蒸汽灭菌锅(山东博科消毒设备有限公司); GZP-450Y 生化培养箱(上海精宏实验设备有限公司); 5418R 高速冷冻离心机(德国艾本德公司); SynergyHTX 多功能酶标仪(美国 BioTek 公司); FDU-2110冷冻干燥机(日本东京理化器械株式会社); VEGA3 扫描电子显微镜(上海泰斯肯贸易有限公司)。

根据CHANG等[20]的方法, 利用牛津杯法测量抗菌肽cp1对蜡样芽胞杆菌抑菌圈。取 100 μL 蜡样芽胞杆菌(106 CFU/mL)均匀涂布到 LB 培养基上, 并在每个平板中用消过毒的镊子放置 3 个灭好菌的牛津杯(外径 8 mm、内径 6 mm、高10 mm), 再轻轻按压。然后将 100 μL 抗菌肽 cp1 水溶液(10 μg/mL)加入每个牛津杯中, 37℃下培养 24 h。最后用游标卡尺测量抑菌圈直径(diameter of inhibition zone, DIZ)。

参照 FEI 等[21]的方法利用肉汤微量稀释法进行测定最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC), 向无菌的 24 孔板中加入灭菌后 LB 培养基, 并添加抗菌肽使其质量浓度分别为 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL。取 2 μL的 106 CFU/mL蜡样芽胞杆菌菌悬液至已凝固的 24孔板中, 37℃培养 24 h, 将肉眼下观察不到蜡样芽胞杆菌生长的最低的抗菌肽 cp1 质量浓度作为 MIC 值。将 100 μL 的蜡样芽胞杆菌菌悬液(106 CFU/mL)分别用 4、8、16 μg/mL 的抗菌肽cp1处理0.5 h后均匀涂布于 LB平板上, 37℃培养24 h, 将蜡样芽胞杆菌菌落无法在培养基中生长的最低抗菌肽cp1 质量浓度记为 MBC 值。

参照穆可云等[22]方法并稍作修改, 将蜡样芽胞杆菌菌悬液(106 CFU/mL)接种到 LB 培养基中, 37℃、250 r/min恒温摇床培养 2 h 至对数生长期。随后, 以等体积的无菌水作为对照组, 试验组加入抗菌肽 cp1 至终浓度分别为0.5、1、1.5、2 MIC, 在 37℃条件下连续培养 12 h。每 2 h取样, 在 600 nm 波长处测定其吸光值。

根据文献[23]的方法取 2 mL 蜡样芽胞杆菌菌悬浮液(106 CFU/mL), 加入抗菌肽 cp1 至终浓度分别达到 1 MIC和 2 MIC, 0 MIC 作为对照组。在 37℃处理 1 h 后, 使用 ATP发光法细胞活力检测试剂盒从细胞中提取 ATP, 然后使用多功能酶标仪进行测定。

参照 SHI 等[24]的描述测定抗菌肽 cp1 对蜡样芽胞杆菌膜电位的影响。将 5 mg 的 BiBAC4(3)用 0.96 mL 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)充分溶解备用。向装有125 μL 蜡样芽胞杆菌菌悬浮液(106 CFU/mL)的黑色不透明96 孔板中加入 0.5 μL 的 BiBAC4(3)荧光探针, 37℃平衡40 min后, 加入抗菌肽 cp1至终浓度分别达到0、1和 2 MIC,处理 5 min 后, 设置激发波长和发射波长分别为 492 nm 和515 nm, 使用多功能酶标仪测定荧光强度。

参照卢彩会等[25]的方法, 用 PBS (0.1 mol/L pH 7.0)将已离心(5000 r/min, 10 min, 4℃)的蜡样芽胞杆菌体悬液(106 CFU/mL)连续漂洗 3 次, 重悬后加入抗菌肽 cp1 至终浓度分别为 0、1、2 MIC, 37℃下孵育 12 h, 每 3 h 取出 2 mL, 离心(5000 r/min, 10 min, 4℃)取上清液, 测定 260 nm 波长下的吸光值。计算核酸在菌液中的含量。每 3 h 取离心后的上清液 0.5 mL, 加入 5 mL 的考马斯亮蓝 R250 试剂, 反应5 min, 测定 595 nm 波长下的吸光值, 再计算其蛋白质含量。

根据 FEI 等[26]方法, 将 106 CFU/mL 的蜡样芽胞杆菌菌悬液加入抗菌肽 cp1 至终浓度分别达到 1 MIC 和 2 MIC, 未处理蜡样芽胞杆菌菌悬液作为对照组, 37℃处理 3 h 后离心(5000 r/min, 10 min, 4℃)。向所得的菌泥中加入 1 mL质量分数 2.5%戊二醛溶液, 在 4℃下固定 2 h。分别用体积分数 30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇溶液进行梯度洗脱固定细胞, 每次 10 min, 随后冷冻真空干燥, 真空镀金, 最后使用扫描电子显微镜观察蜡样芽孢杆菌形态。

(2)抗菌肽 cp1 对巴氏杀菌乳感官评定的影响 

参照 GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》严格进行测定, 测定在 4℃贮藏条件下 4、8 和 12 d 巴氏杀菌乳中菌落总数。

所有实验均重复 3 次, 结果表示为平均值±标准偏差, 使用 SPSS 20.0 软件通过方差分析和邓肯检验进行统计学分析, 并检验其显著性, P<0.05 为不同组之间差异显著, 利用 Origin 2019 软件作图。

2 结果与分析

2.7 抗菌肽 cp1 在巴氏杀菌乳中的应用

3 结 论

控制牛奶中蜡样芽胞杆菌的数量对于保障乳制品食品安全性至关重要, 但目前缺乏有效的抑制牛奶中蜡样芽孢杆菌的食品生物防腐剂。本研究利用抗菌肽 cp1, 并通过一系列相关实验, 揭示了抗菌肽 cp1 对腊样芽孢杆菌的抑菌作用及在巴氏杀菌乳中的应用。研究结果表明, 抗菌肽cp1 对腊样芽孢杆菌具有明显的抗菌作用, 抗菌肽 cp1 导致细胞内 ATP 含量降低、细胞膜超级化, 渗漏胞内蛋白质和 DNA, 细胞形态破坏。此外, 抗菌肽 cp1 抑制蜡样芽胞杆菌在巴氏杀菌乳中生长的能力, 添加后对牛奶的感官均无显著影响, 并对贮藏期间的微生物的生长繁殖具有抑制作用, 还延长保质期 12 d。综上, 说明抗菌肽 cp1 具有抑菌、保鲜潜力, 这些研究结果可为抗菌肽 cp1 在食品、制药、饲料等领域内作为生物防腐剂或多功能食品添加剂的应用提供理论依据。

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