［摘要］ 抗菌肽是一种小分子活性肽，来源广泛，在生物体免疫激活和调节中发挥重要作用，且具有抗菌活性，这为解决抗生素耐药性问题提供了可能。LL‐37是组织蛋白酶抑制素家族中唯一在人体内的成员，对革兰阴性菌和革兰阳性菌均有抑制作用。该文从LL‐37活性结构域进行分析，阐述了LL‐37在抗菌、抗内毒素、创伤愈合、免疫调节等方面的作用机制及临床治疗潜力，展望了其应用前景，为新药研发、食品防腐和动物饲料添加提供思路。

抗生素曾在世界上占有重要的地位，拯救过无数人的生命，在农药、食品添加剂、畜牧类养殖中发挥了重要作用，成为热门的抗菌药。然而，在 20 世纪70年代后，研发出高效抗生素却成为难题。由于抗生素的长期使用，越来越多的细菌表现出耐药性，甚至产生了顽强的“超级细菌”［1~4］。细菌抗药性的增强使诸多抗生素失去效力，因此，开发能够替代抗生素的新型有效产品刻不容缓［5，6］。

抗菌肽来源广泛，最早发现于昆虫的免疫系统中。随后，从细菌、真菌、两栖动物、高等植物和哺乳动物中也提取了类似的多肽。这种活性肽具有天然免疫功能，是宿主抵抗病原微生物入侵的重要分子屏障，因此被称为抗菌肽［7，8］。抗菌肽具有抗菌谱广、相对分子质量小、热稳定性高、水溶性好等特点。目前研究已涉及到分子结构、分子改良、作用机制等多方面［9］。从抗菌机制方面来看，抗生素作用于特殊受体，细菌可通过变异来对抗它的作用，最终导致耐药菌的产生。而抗菌肽可经过物理作用使细胞膜穿孔，最终达到广谱抗菌的效果，因此不易产生耐药性。所以，抗菌肽极其可能成为抗生素的替代品［10］。

其中，人源性抗菌肽细胞毒性低且排异反应小，显示出一定的临床治疗优势［11］。目前人源抗菌肽有组织蛋白酶抑制素（cathelicidin）家族、防御素（defensin）家族、富含组氨酸蛋白家族等［12］。防御素家族是一种内源性抗菌肽，抗菌活性较强，仅 1~10 µg即显示出抑菌活性。组织蛋白酶抑制素家族是哺乳类动物特有的抗菌肽，LL‐37 是其唯一在人体内的抗菌肽，具有多种作用。组织素（histatin）是一类富含组氨酸的抗菌肽，有较强抗细菌和抗真菌活性［13］。随着医学技术精进，多种人源抗菌肽已进入临床试验［14］，如人乳铁蛋白1‐11（human lactoferrin1‐11，hLF1‐11）已进入临床Ⅱ期阶段，用于骨髓移植过程抗感染治疗；天蚕素 B衍生物（HB‐107）进入临床前期，用于创伤修复；来源于猪抗菌肽的类似物（protegrin analogue，IB‐367）进入Ⅲ期临床试验，用治疗黏膜炎［15~17］。所以，人源抗菌肽极有可能成为研究热点。

LL‐37 主要合成部位为中性粒细胞，具有两亲性α螺旋结构，可由巨噬细胞、单核细胞、角蛋白细胞、中性粒细胞等进行分泌［18］。LL‐37具有抑制革兰阳性（G+）及革兰阴性（G-）菌活性特点，并有抗内毒素、趋化作用、促进血管生成作用等功能，这些都显示出其代替抗生素的可能性。但抗菌肽由于含量较少，且分离纯化步骤复杂，不易提取，费用昂贵，传统分离方法已不适合大量生产［19］。现今多采用基因工程化生产，筛选出表达量高、高抗菌活性、低毒性抗菌肽，并进行下一步分析［20］。

然而，相比于抗生素，LL‐37抗菌活力仍然处于劣势，如何提高抗菌活性并降低溶血活性和细胞毒性是关键点［21］。目前，将目的基因导入载体内进行高效表达是较为理想的手段。在进行修饰改造前，人们需要在基本不改变抗菌肽优势结构前提下，通过氨基酸置换、部分序列截取和组合化学库等方法获得目的抗菌肽，这将是未来构建优效抗菌肽的重要方法［22，23］。改变抗菌肽对细菌细胞膜的结合作用，对抗菌肽抑菌活性调控有关键作用。杨艳丽等［24］分别用 Gln16、Asn26 和 Gln36 取代 Glu16、Asp26 和Glu36，使静电从+5.8 增加到+9.0。这种修饰提高了LL‐37 正电荷水平，并未改变 LL‐37 空间结构。Ga‐gnon 等［25］发现肽链长度也与抗菌活性有关。在肽链长度相同情况下，长度越长，正电荷越多的抗菌肽抗菌效果越好。

因此，本文对 LL‐37 抗菌肽的生物结构进行解析，分析不同区域的关键作用，并对生物学特性（抗菌、抗内毒素、免疫调节、促进血管生成）等方面进行阐述，将为人类抗菌肽的开发提供理论依据，并在LL‐37潜在应用方面提供思路。

1 LL⁃37生物结构及生物功能

1.1 生物结构

人阳离子抗菌蛋白18（human cationic antimicrobialprotein 18，hCAP18）是组织蛋白抑制素家族成员，以主要蛋白形式存在于中性粒细胞中，由睾丸、骨髓、肺上皮细胞、炎性上皮角质形成细胞、食管、宫颈等产生，主要通过具有抗菌活性的 C 端与脂蛋白连接［26］。hCAP18以非活性前体蛋白形式储存在颗粒中，在一定条件下分裂出其中的C端活性肽，即LL ‐37肽［27］。在体内 hCAP18 出胞后，蛋白酶 3 对其进行裂解。有实验表明，只要蛋白酶 3 浓度足够高，hCAP18就能全部生成LL‐37［28］。

LL‐37的 N端前含有的两个赖氨酸残基（L），且由 37 个氨基酸组成，因此得名 LL‐37［29］。LL‐37 可在人体各组织器官中表达，特别是在消化道、皮肤、泌尿道和口腔上皮细胞中。此外，它也表达在一些伤口渗出液、汗液和血液中［30］。LL‐37 基因启动子区域内包含 1个 TAAA 序列、1个白介素 6核转录因子（nuclear factor interleukin‐6，NF‐IL‐6）结合位点、3个 急 性 期 反 应 因 子（acute phase response factor，APRF），可与体内生成的炎症因子结合，从而增加LL‐37基因表达水平［31］。

在纯水中，LL‐37形成不规则的螺旋结构，当周围环境改变 α 螺旋结构时，会形成两亲性阳离子结构。LL‐37存在的C端和N端α‐螺旋，两端的螺旋线通过转折或弯曲分开。第 5、6、17和 27位苯丙氨酸侧链向同一方向延伸，形成疏水表面，正电荷残基和疏水表面可与负电荷分子结构直接相连，如G+脂糖、G-磷壁酸等［32］。在人体汗液中，hCAP18修出 LL‐37片段产物（KS‐30和 RK‐31），二者的 N端氨基酸含量比 LL‐37 少 6/7，具有较强的抗菌活性，但不具有免疫调节能力［33］。另外，LL‐37在缺乏N端4种氨基酸时，仍能保持抗菌活性，但大部分溶血活性丧失。这些结果表明，N端螺旋对多肽的寡聚、趋化、溶血和抗蛋白酶水解有重要作用。许多实验小组研究了截短肽的活性，以了解 LL‐37 最小抗菌区域［34］。结果表明，LL‐37的最小区域在氨基酸17~29位或 18~29 位之间，表明 LL‐37 的 C 端螺旋具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等作用。

研究显示，恒河猴的同源蛋白 RL‐37 净正电荷为+8，大于 LL‐37 的+6，抗菌活性要高于 LL‐37［35］。因此增加LL‐37中的碱性氨基酸数目而不改变其α‐螺旋构象可提高其抗菌活性［36］。肽链中带正电荷和疏水性氨基酸的数目也与其他活性有关，并具有构象依赖性特点，因此可通过以下方式改造：①在结构上应为管状或螺旋状，在形状上保持分子的亲水性和疏水性；②搭配正电性与负电性氨基酸、亲水性与疏水性氨基酸，辅以易形成螺旋状结构氨基酸，提高抗菌肽活性；③增加正电性和疏水氨基酸的数量来提高杀菌力和抗内毒素能力。

1.2.2 抗内毒素作用 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）主要位于 G‐细胞外膜上。参与过程主要有：①在 LPS 诱导的 Toll 样受体（Toll‐like receptor，TLR）‐核因子 κB（nuclear factor kappa‐B，NF‐κB）信号通路中，LL‐37 起调节作用。此外，LL‐37 抑制 LPS 诱导的 NF‐κB亚单位 p50及 p65的转录［41］。②丝裂原活化蛋白激酶（mitogen ‐activated protein kinase，MAPK）通道被激活，从而增加促炎反应通道活性［42］。③选择性地调节基因转录，降低促炎反应基因 p50及肿瘤坏死因子‐α（tumor necrosis factor‐α，TNF‐α）的表达。④抑制 LPS 与 LPS 结合蛋白（LPS‐binding pro‐tein，LBP）、髓样分化蛋白 2（myeloid differentiationprotein 2，MD‐2）或 TLR 复合物相结合，降低下游通路的激活。经过这些机制调节，由LPS引起的不良反应可被LL‐37有效抑制。

1.2.3 免疫调节作用 在稳定状态条件下，中性粒细胞发生结构性凋亡，以结束其短暂寿命。中性粒细胞坏死或凋亡后，在炎症部位形成中性粒细胞胞外杀菌网络（neutrophil extracellular traps，NET），可提供高浓度抗菌分子，快速控制体内细菌感染［43，44］。参与多种慢性炎症的 NET 可在体内外释放 LL‐37，同时LL‐37也促进外周中性粒细胞以剂量依赖方式形成 NET。而 NET通过 C1q（血清补体）/LL‐37特异性抑制LPS激活的巨噬细胞分泌IL‐6［45，46］。早期研究表明，LL‐37 来源的成熟树突状细胞（maturationof dendritic cell，mDC）与LPS产生了一个典型的辅助性T细胞（helper T cell，Th1）诱导细胞因子谱（IL‐12、IL‐6 和 TNF‐α 显著增加，IL‐4 显著降低）。此外，在mDC刺激下，T细胞对免疫活性物质γ干扰素（interfer‐on gamma，IFN‐γ）的合成显著增加。因此，LL‐37似乎是先天免疫系统和适应性免疫系统之间的桥梁。通过评估 LL ‐37 在外周血单个核细胞（peripheralblood mononuclear cells，PBMC）中的作用，研究人员发现LL‐37也促进调节性T细胞产生，而不影响T细胞活化；在炎症［植物血凝素（phytohemagglutinin，Pha）激活］背景下，LL‐37肽可诱导静息T细胞增殖，显著降低促 PBMC 促炎因子表达（IFN‐γ，TNF‐α）；表明当肽发挥自身抗感染特性时，该反应始终控制促炎反应，以保护机体免受严重炎症反应［47］。而且，LL‐37 调节 TLR 3 的表达，促进分泌更高水平抗炎因子［吲哚胺2，3‐双加氧酶（indoleamine2，3‐dioxy‐genase，IDO）］、IL‐10和转化生长因子β（transforminggrowth factor‐β，TGF‐β），并提高间充质干细胞对过度刺激的T细胞的抑制功能。因此，LL‐37可能提供对机 体 的 保 护 ，并 通 过 多 种 途 径 发 挥 免 疫 调 节作用［48］。

1.2.4 创伤愈合 血管生成、上皮细胞迁移和增殖、成纤维细胞抑制胶原生成是上皮创伤愈合的 3个关键因素，大多数作用是通过激活表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）介导。LL‐37的存在可加速G蛋白偶联受体（G protein‐coupledreceptors，GPCR）对 EGFR 反式激活，促成角化细胞迁移，促进创面修复。LL‐37还可诱导血管生成，可将内皮前体细胞聚集到损伤需要修复部位，激活内皮细胞，促进内皮细胞增殖，形成血管样结构［49］。

除上述功能外，LL‐37还具有抗病毒、抗真菌等作用，这将为LL‐37投入到临床试验提供依据。

2 LL⁃37临床治疗潜力

嗜神经单纯疱疹病毒 1（herpes simplex virus 1，HSV‐1）是人类疱疹病毒科的一员，可作用于口腔和生殖器黏膜［50］。有研究显示 LL‐37 对 HSV 复制有显著影响。干扰素有抗病毒作用，在经 LL‐37 处理的感染 HSV‐1 角质形成细胞中，显示 5 个重要干扰素刺激基因［干扰素诱导的四肽重复蛋白1（interferon‐induced protein with tetratricopeptide repeats 1，IFIT1）、干扰素刺激外切酶基因 20 kDa（interferon stimulatedexonuclease gene 20 kDa，ISG20）等］表达增加［51］。在体外细胞培养实验中，vero 细胞（非洲绿猴肾细胞）用 LL‐37 预处理，然后用 HSV‐1 感染，也检测到HSV‐1复制显著减少［52］。有学者用脂质体LL‐37处理 HSV‐1感染的 HaCaT 细胞（人永生化角质形成细胞），结果发现，与游离LL‐37多肽相比，纳米脂质体LL‐37 毒性更小，保质期更长，更易被吸收。因此，脂质体 LL‐37 为预防 HSV‐1 感染提供了思路，很有可能成为潜力药物［53］。

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型（severeacute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS‐CoV‐2）是引起当今流行的新冠肺炎的主要病原体，这种包膜单链RNA病毒可导致急性呼吸系统疾病，严重时可致死亡［54~56］。数据结果表明，维生素 D 上调 LL‐37表达，它可直接或间接作用于 SARS‐CoV‐2，阻止其复制，增加抗炎细胞因子的产生，减少促炎免疫反 应［57］ 。采 用 间 充 质 干 细 胞（mesenchymal stemcells，MSC）及其衍生物治疗 SARS‐CoV‐2 感染的临床试验正在进行中。MSC产生多种可溶性因子，包括 抗 菌 肽 LL ‐ 37，可 与 病 毒 结 合 并 使 其 复 制 失效［58，59］。然而，LL‐37抗 SARS‐CoV‐2的机制尚不明确，需进一步探索。

埃博拉病毒（Ebola virus，EV）是一种来自丝状病毒科的单链RNA病毒，有较强感染性和较高死亡率［60］。最近发现，LL ‐37 和 LL ‐37 变体（GI ‐20 和17BI）在抑制重组型水泡性口炎病毒［可表达EV‐糖蛋白（glycoprotein，GP）］和野生型 EV 感染中起到重要作用。这些LL‐37药物通过损害HeLa细胞系（人宫颈癌细胞）中的组织蛋白酶b介导的EV糖蛋白加工，能抑制 EV细胞进入，但不能控制病毒复制。更重要的是，两种含有D‐氨基酸改良抗菌肽对胞内酶解具有抵抗力，比 L型抗菌肽更有效［61］。这些有望进一步探索它们在动物模型中预防 EV 感染作用，以及与抗病毒药物联用的可能性。

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是第二大最致命的癌症，占癌症死亡率 9.2%［62］。LL‐37在正结肠黏膜中表达强烈，但在结肠直癌组织中表达下调。低LL‐37水平已被认为是结直肠癌的生物标志物。同时，LL‐37可降低抑制凋亡B细胞淋巴瘤‐2基因（b‐cell lymphoma‐2，Bcl‐2）水平，提高促凋亡 Bax/Bak（Bcl‐2基因亚家族成员）水平。LL‐37也增加了P53 上调凋亡调节因子（p53 upregulated modulatorof apoptosis，PUMA）和肿瘤抑制基因 p53 的表达，PUMA 是 p53 的直接靶点，也是结直肠癌细胞凋亡的调节因子。在结肠癌细胞中，LL‐37 显著诱导凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）和内切酶G（endonuclease G，EndoG），导致胱天蛋白酶（cysteinylaspartate specific proteinase，caspase）非依赖性凋亡。在结肠癌细胞中，一种基于LL‐37的机制激活GPCR‐p53‐Bax/Bak/Bcl‐2信号级联，触发 AIF/endog介导的凋亡［63，64］。当LL‐37附着在磁性纳米颗粒（magneticnanoparticles，MNP）表面时，其抗癌活性有所提高，显示出一定潜力［65］。

在胃癌细胞中，LL‐37 含量显著低于正常胃组织。有研究显示 LL‐37 通过骨形态发生蛋白（bonemorphogenetic protein，BMP）信号通路调节蛋白酶体激活［66］。BMP信号触发Smad（Sma‐ and Mad‐relatedprotein）1/5/8的募集和磷酸化，与Smad4形成异源二聚体，该 Smads 复合物随后上调细胞周期调控基因p21Waf1的表达水平。在该途径中，LL‐37也可诱导低水平的细胞周期蛋白 E2。p21Waf1和细胞周期蛋白E2 表达水平的改变可引起 G0/G1期细胞周期阻滞。所以，LL‐37 通过蛋白酶体依赖的机制激活 BMP 信号通路，抑制胃癌细胞增殖。

口腔鳞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）属于头颈部常见恶性肿瘤，其组化分析显示，与正常口腔黏膜组织相比，LL‐37 低表达与组织学分化和淋巴结转移有关。这说明 LL‐37 可能在 OSCC 中是一种肿瘤抑制因子。hCAP18在一些口腔癌细胞系中的表达调控涉及到人类 CAMP 启动子区域的DNA 甲基化状态［68］。也有研究表明，hCAP18 在OSCCSAS ‐H1 细胞中诱导胱天蛋白酶非依赖性凋亡 ，但在人牙龈成纤维细胞或 HaCaT 细胞中则无［69］。最近报道表明，一些癌细胞具有富含胆固醇的脂筏，这也可能是控制 LL‐37 对不同癌细胞选择性的关键因素，从而为 LL‐37 抗癌机制提供了一种新的可能性［70，71］。

此外，LL‐37 在血液恶性肿瘤中也发挥一定抑制作用，机制可能与引起细胞凋亡通路有关。这些结果为肿瘤临床治疗提供了方向。

3 LL⁃37应用前景

特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）患儿TLR2和LL‐37的低表达及血清LL‐37的低水平提示AD存在先天免疫和皮肤屏障功能缺陷等问题。维生素D可能激活维生素D受体，通过TLR2途径促进LL‐37表达，从而对 AD 起到保护作用［72］。或许未来可设计LL‐37有关药物辅助维生素D对抗特应性皮炎。

新生儿败血症主要由感染引起，随着耐药菌的产生，抗生素选择变得越来越棘手，因此提高自身抵抗力尤为重要。有研究显示维生素D可提高机体抗菌肽 LL‐37 的表达，从而提高机体防御感染的能力，为抗生素治疗提供有力保障。这将为设计抗生素替代品的药物提供思路［73］。

LL‐37 抗菌谱广且抗菌活性高，细菌不易产生耐药性，还能中和内毒素，可以视为抗生素的新型替代品。因此选择合适的表达模板来表达LL‐37的类似物，对于生产具有高效抗菌、高营养的动物饲料添加剂有促进作用，使其拥有一定的经济效益。

4 展望

抗菌肽LL‐37相对分子质量小，结构特殊，生物学功能多样，其广谱抗菌特性受到人们青睐，而不易产生耐药性的性质，使其很有可能成为抗生素替代品。此外，抗菌肽在食品中的无毒性表现，也有可能使其成为新一代食品添加剂。抗菌肽的使用，可更有效地防止动物疫病流行，减少畜牧业损失，这将极大促进我国畜禽养殖业健康发展。使用抗菌肽可增强动物对疾病抵抗力，减少疾病传播和抗生素使用，从而减少药物在动物体内及其产品中的残留，为我国广大消费者提供了更安全的肉类食品。由于抗菌肽具有广谱抗菌性，对G+和G-均有很好抑杀作用，因此可广泛应用于畜禽养殖业。抗菌肽具有广阔应用前景，利用基因工程技术生产重组抗菌肽产品具有很好的临床效果。国内也有部分企业开发出了抗菌肽产品（如天蚕素抗菌肽），在动物生产中得到了较好应用效果。抗菌肽的研究热潮势必带动一些产业的绿色革命，在医药方面，人们在努力开发绿色、高效、低毒抗感染药物。在农牧业方面，抗菌肽作为新型饲料添加剂也已投入生产，而其在食品工业方面也表现出巨大开发潜力。随着研究深入，抗菌肽作为添加剂在饲料中的广泛应用终将变成可能。抗菌肽在未来发展中具有无限潜力，应予以重视，以挖掘其潜在的社会应用价值。

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