它通常由高效液相色谱法（HPLC）测定。
肽不仅包含正确的肽，还包含杂质，例如生产中的水和有机盐。肽纯度是指相对于所有杂质（水分除外）正确肽的数量。然而，肽含量是目标肽相对于样品中其他所有物质的百分比，通常由 N 元素分析和氨基酸分析确定。因此，即使肽纯度达到99%，考虑到水和有机盐，含量仍可能为70%-80%。
最常见的技术是反相高效液相色谱 (RP-HPLC)。
最常见的流动相是水和乙腈，三氟乙酸充当离子对试剂。根据不同的肽段，采用合适的梯度洗脱进行分离。
其他用于多肽分离纯化的流动相或离子对试剂包括乙酸体系、磷酸体系、盐酸体系、七氟丁酸等，可通过调节pH达到很好的分离效果。
大多数肽可以溶解在超纯水中。对于一些不溶性肽，需要先分析氨基酸序列。酸性肽可先溶于少量碱性溶液（如0.1%氨水），然后稀释至所需浓度。作为碱性肽，可溶于少量酸性溶液（如乙酸、三氟乙酸），然后稀释至所需浓度。对于疏水肽，可溶于强极性有机溶剂，如DMF、甲醇、丙醇、异丙醇、DMSO等。
最常见的填料是 C18、C8 和 C4 反相色谱柱。
不同序列的肽在理化特性和疏水性方面表现出很大差异。在大多数情况下，C18 色谱柱对分子量小于 4000 或亲水性的肽段的分离效果最好。C4 柱适用于分子量超过 5000 或疏水末端。C8列介于C18和C4之间，其效果更类似于C18。对于一些特殊的选择性肽段，也可以选择苯基柱和聚合物柱。
当需要更高的 pH 或温度时，具有宽 pH 范围的聚合物 HPLC 柱可能适用于纯化。它们在极端pH条件下不会降解，因此可以使用强酸和强碱作为流动相进行分离和纯化。
影响因素很多，主要包括流动相、色谱柱类型、柱温、波长、色谱仪性能等。这些差异可能会导致最终结果出现错误。
只要不超过耐受范围，冻干可能是去除大部分 TFA 和乙腈的最简单和最有效的方法。但该方法不能满足一些对TFA含量要求较高的多肽类药物的要求。应与它们进行特殊的盐转化和脱盐。
大多数肽在TFA系统下纯化，因此TFA盐是最常见的形式，其次是乙酸盐和盐酸盐形式，很少有肽药物是特殊盐形式。离子交换和 HPLC 是最常用的盐转化方法，而 G25（GE Healthcare 的葡聚糖凝胶）柱可用于脱盐。
同时，TFA 可以抑制硅胶表面的硅烷醇基团，改善碱性化合物的峰形。如果使用 0.1% TFA 有时分离效果不好，可以尝试 0.2% TFA，但使用后需要立即冲洗色谱柱。在梯度洗脱时，由于基线漂移，它对制备的影响很小。
