［摘要］ 目的 以新型冠状病毒（SARS⁃CoV⁃2）刺突蛋白（S1蛋白）为靶点，筛选抗新冠病毒的多肽类药物。方法以S1蛋白为靶蛋白，利用噬菌体展示技术，从噬菌体随机12肽库中筛选亲和多肽，通过酶联免疫吸附实验（ELISA）验证筛选多肽与靶蛋白的亲和性，并对筛选出的亲和多肽进行细胞水平验证。结果 多肽p27与S1蛋白具有较强亲和性，并有阻止SARS⁃CoV⁃2假病毒进入细胞的作用，IC50为73 μmol/L。结论 多肽p27可能有抗SARS⁃CoV⁃2活性，具有开发成抗新冠病毒多肽类药物的潜力。
新型冠状病毒（SARS⁃CoV⁃2）的出现和迅速蔓延严重损害了人类健康并正在破坏全球经济。SARS⁃CoV⁃2迄今已感染一亿多人，造成300多万人死亡［1］，世界大部分地区采取封控模式来阻止病毒的传播，造成了巨大经济损失［2，3］。
文献报道，血管紧张素转换酶 2（angiotensinconverting enzyme 2，ACE2）是新冠病毒进入细胞的受体［4］。病毒表面的刺突蛋白（spike protein，S 蛋白）在膜渗透和感染机制中起到关键作用。S 蛋白由 S1 和 S2 两部分构成，S1 是与受体 ACE2 结合部分［5，6］，是新冠病毒进入宿主细胞导致病毒感染和发病的重要决定因素。
噬菌体展示技术（phage display technique，PDT），是一种随机筛选技术［7，8］，它使大量的随机多肽与其DNA 编码序列建立直接联系［9］，在噬菌体颗粒表面快速生成数十亿个极高多样性肽，可针对靶分子进行迭代筛选［10］。该技术在多肽药物研究领域有巨大应用前景。
为获得抗新冠病毒的多肽类药物，本研究以新冠病毒S1蛋白为靶蛋白，利用PDT，经过3轮筛选和富集，获得与靶蛋白具有亲和性的候选结合肽，应用酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbentassay，ELISA）验证多肽与靶蛋白亲和性，并在细胞水平上进一步验证其阻止 SARS⁃CoV⁃2假病毒进入细胞的效果，从而得到与新冠病毒S1蛋白有较高亲和性并有可能抗SARS⁃CoV⁃2活性的多肽，为以S1蛋白为作用靶点的抗新冠药物研究提供新的方向，并发现具有抗 SARS ⁃CoV ⁃2 的多肽类药物的先导化合物。
1 材料与方法
噬 菌 体 随 机 表 面 展 示 12 肽 库（美 国 NEWENGLAND BioLabs公司）；SARS ⁃CoV ⁃2 Spike S1⁃HisRecombiant Protein（40591⁃V08H）、M13 BacteriophageAntibody（HRP）（11973 ⁃ MM05T ⁃ H）、SARS ⁃ CoV ⁃ 2Spike antibody（40150⁃D001）（均北京义翘神州科技有限公司）；异丙基⁃β⁃D⁃硫代半乳糖苷（isopropyl⁃beta ⁃D ⁃thiogalactopyranoside，IPTG，1122GR005）、5⁃溴⁃4⁃氯⁃3⁃吲哚⁃ β⁃D⁃半乳糖苷（5⁃bromo⁃4⁃chloro⁃3⁃indolyl β⁃D⁃galactopyranoside，XGal，1100GR001）（均广州赛国生物科技有限公司）；3，3′，5，5′⁃四甲基联苯胺显色液（3，3′，5，5′⁃tetramethylbenzidine，TMB，P0209，碧 云 天 生 物 技 术 有 限 公 司）；HEK ⁃ 293TACE2 过表达细胞株（41107ES03）、COVID⁃19⁃SpikeProtein Pseudovirus（11906ES70）、萤火虫荧光素酶报告基因检测剂盒（1140ES80）（均翌圣生物科技有限公司）；细胞增殖毒性检测试剂盒（Cell Counting Kit⁃8，CCK⁃8，CK04，日本同仁化学研究所）。
1.2 方法
1.2.1 噬菌体随机 12 肽库筛选亲和性多肽 以SARS⁃CoV⁃2 S1 蛋白为靶蛋白，利用噬菌体随机 12肽库筛选亲和性多肽，将 S1 蛋白用包被液稀释至100 μg/ml，包被于 ELISA 板上，4℃湿盒孵育过夜。弃包被液，加 5 mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）封闭液，37℃封闭 1 h。用 Tris 盐酸缓冲液+吐温⁃20（TrisBuffered Saline with Tween⁃20，TBST）洗涤后，加噬菌体原库 1×1011 PFU，室温摇育 1 h。用 TBST 洗涤后加非特异性洗脱缓冲液（甘氨酸⁃盐酸），用 pH 9.1Tris⁃HCl 中和，收集洗脱液。取 5 μl 洗脱液测定滴度，剩余扩增、纯化，用于下一轮筛选，共进行 3 轮筛选。
1.2.2 ELISA 验证筛选噬菌体单克隆与 S1 蛋白结合的亲和性 将筛选到的噬菌体上清梯度稀释，采用双层琼脂法，平铺于 IPTG/Xgal 固体培养基上，从接近 100个噬菌斑的平板上挑取 80个噬菌体蓝斑，分别扩增；扩增后噬菌体上清一半用于无水乙醇法快速提取 DNA，送公司测序；剩余测定滴度用于ELISA验证。样品孔包被S1蛋白，BSA为空白孔，置4℃湿盒中过夜。次日，弃包被液，加 BSA 稀释液37℃封闭1 h，拍掉闭液，加相同浓度噬菌体上清，室温摇育 1 h，弃噬菌体，用 TBST 洗板 6 次后，加抗M13 抗体稀释液，摇育 1 h，TBST 洗板 6 次，加 TMB显色液，室温 20 min，加终止液，酶标仪检测 450 nm处光密度（D450）值。
1.2.3 筛选亲和多肽的合成 测序得到 DNA 序列后推导出氨基酸序列，根据多肽的氨基酸序列，合成带有生物素标记的多肽。
1.2.4 ELISA 验证筛选多肽与 S1 蛋白结合特异性 用包被液稀释链霉亲和素 10 μg/ml，包被于ELISA 板上，4℃湿盒中孵育过夜。拍掉包被液，加5 mg/ml BSA，0.1 μg/ml链霉亲和素封闭液，4℃封闭1 h；加筛选结合肽，室温摇育 1 h；用 TBST 洗涤后，加S1蛋白，作用1 h；用TBST洗涤后，加抗S1蛋白小鼠源抗体，室温摇育 1 h，TBST 洗涤后，加入 HRP 标记的抗小鼠抗体，室温作用 1 h；TBST 洗涤后，加入TMB 显色液，室温反应 15 min，加终止液，酶标仪检测450 nm处光密度（D450）值。
1.2.6 细胞毒性实验 取对数生长期 HEK⁃293T⁃ACE2细胞，以1×104细胞/孔密度铺于96孔板，37℃、5%CO2培养 18 h。将梯度稀释多肽 p27 加入细胞中，继续培养 48 h 后，加 CCK⁃8 试剂，37℃继续培养40 min，酶标仪测D450值。
采用 GraphPad Prism 7 软件进行统计学分析，数据以xˉ±s 描述，计算出IC50值，采用t检验以及单因素方差分析，Dunnett⁃t进行两两比较，P<0.05代表差异具有统计学意义。
2 结果
3 讨论
SARS⁃CoV⁃2 S1蛋白可通过与靶细胞受体ACE2结合介导病毒侵入过程，是病毒治疗药物和疫苗研究的关键靶点。本研究以 S1 蛋白为靶蛋白，通过PDT，筛选与靶蛋白具有亲和性的结合肽，通过ELISA验证结合肽与S1蛋白的亲和性［11，12］，发现p27、p5和p45 与 S1 蛋白有较强的亲和性。SARS⁃CoV⁃2 假病毒是将慢病毒载体中的包膜糖蛋白用新冠病毒 S蛋白替代，可形成模拟新冠病毒感染的假病毒［13］。假病毒通过表面 S 蛋白感染 HEK⁃239T⁃ACE2 细胞并表达报告荧光素酶基因。结果显示，p27 可阻止新冠病毒S蛋白假病毒进入HEK⁃239T⁃ACE2细胞，提示结合肽p27可能会阻断S1蛋白与ACE2受体的结合，但尚不能确定其在阻止 S1 蛋白与 ACE2 受体结合中的作用如何。后续将深入探究p27能否阻止S1 蛋白与 ACE2 受体的结合，并对其作用机制及体内外抗SARS⁃CoV⁃2的活性进行研究。同时，以p27作为先导化合物，对其进一步修饰优化，以提高抗病毒活性。后续可探索 p27 对 SARS⁃CoV⁃2 病毒的抑制作用，研发抗新冠病毒的多肽类药物。另外，对于筛选的p45、p5结合肽可作为靶向性载体，递送其他具有抗 SARS⁃CoV⁃2 的药物，提高药物靶向性及生物利用度。
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