摘要 ：以基质金属蛋白酶-14(MMP-14)催化结构域为靶标，通过噬菌体随机十二肽库筛选和分子模拟、细胞免疫荧光、金属离子亲和层析以及体外细胞作用测定等技术，进行了双靶向 MMP-14 和金属离子小分子结合多肽的筛选与研究. 经 4 轮筛选，噬菌体得到有效富集并获得 13 条不同的多肽序列. 序列分析显示，可能的一致序列有:AHQLH、HHXH、EI / L PLL / I . 分子模拟与对接进一步确认一致序列 AHQLH、HHTH、LPLL 与 MMP-14 催化结构域的氨基酸 120-125 区域良好分子对接并具有一定的专一性，多条 MMP-14 结合肽不仅靶向 MMP-14，同时结合金属离子. 细胞生物学研究确认，所测定的结合肽噬菌体对 MMP-14 诱导表达的 MG63 细胞具有良好的结合作用，揭示结合肽对MMP-14 的靶向结合特性，并且合成的 AHQLH、LPLL 一致序列多肽对 MG63 细胞活力具有一定的抑制能力. 这些新的和具有一定 MMP-14 专一性的一致序列可望用于靶向 MMP-14 抗肿瘤药物的研发和利用.
基质金属蛋白酶( MMPs)是一类结构相关的Zn2+和Ca2+依赖的内肽酶，属于分解细胞外基质组分( extracellular matrix，ECM ) 的蛋白水解酶超家族［1］. 自 1962 年首次由Gross和Lapiere 报道特异性胶原降解酶胶原酶以来［2]，至今至少已发现 23 种人MMPs. 研究结果显示，MMPs 在许多生理和病理过程如胚胎发育、形态建成、组织修复和重建、血管发生、炎症反应，特别是在肿瘤侵袭与转移中发挥着重要的作用［3，4］. MMP-14(也称为 MT1-MMP)作为第 1个鉴别的膜型基质金属蛋白酶，直接或间接降解细胞外基质中的多种组分，被认为是MMPs家族中与肿瘤关系最密切的酶［5］.
生物技术的飞速发展为高通量快速筛选药靶结合分子提供了新的思路和途径，噬菌体展示技术就是近年来发展迅速且广泛应用的手段之一. 它是将编码外源多肽(蛋白) 的基因或DNA片段与噬菌体的外壳蛋白融合而 展 示 在 噬 菌体表面. 若插入的DNA片段为随机寡核苷酸，则构建获得噬菌体随机肽库. 该技术的最大优点是将表型与基因型直接联系在一起，利用配体与靶受体的特异性亲和力可筛选出靶分子高效结合肽. 目前已开展多种 MMPs 相关蛋白的噬菌体文库筛选工作，这方面国内外均有相关研究报 道［6 ～ 10］. 尽 管 如 此，靶 向 MMP-14 的 生物文库筛 选 少 有 研 究，而 深 入 开 展 双 靶 向 MMP-14和金属离子的结合肽分子筛选与研究则未见报道.
本研究以人工合成的 MMP-14 催化结构域为靶标，利用商品化噬菌体随机十二肽库对其进行筛选，通过多轮筛选富集获得与靶标特异性结合的多肽，确定一致序 列，并对其进行同源序列比对、分子模拟、金属离子亲和层析、体外细胞测定等分析，确定结合肽对 MMP-14 和金属离子的双靶向性以及细胞活力的抑制作 用，为 基 于 MMP-14 的 抗 肿 瘤 先 导 药物筛选和研发提供前期工作基础.
1 材料与方法
1. 1 材料
噬菌体随机 十 二 肽 库(1. 5 × 1013pfu /mL) 和 宿主菌 ER2738( F'lacIq Δ( lacZ)M15 proA + B + /zzf ﹕﹕Tn10( TetR ) fhuA2 supE thi Δ( lac-proAB) Δ ( hsdMSmcrB)5 ( r k－ mk－ )McrBC － )购自 New England Biolabs(Cat. 8110S) ;人成骨肉瘤 MG63 细胞，教育部生物材料重点实 验 室 屈 树 新 教 授 惠 赠;Hitrap 树 脂 购 自Pharmacia Biotech(Cat. 17-0575-01) ;Ni-NTA 树脂购自 Qiagen( Superflow 30430) ;MMP-14 蛋白催化结构域购自北京友谊中联生物科技有限公司;.除标明外，其它试剂均购于成都试剂公司，化学试剂均为分析纯以上.
1. 2 MMP-14 靶蛋白的噬菌体随机十二肽库筛选
以 MMP-14 蛋白催化结构域(100 μg /mL) 为靶标，BSA 为阴性对照，筛选、扩增、滴度测定、噬菌体单链 DNA( ssDNA) 的制备和测序等方法参照 Ph.D. -12 TM噬菌体展示肽库手册. 每孔加 入 150 μL 样品包被 96 孔 板，增 湿 容 器 中4 ℃ 轻 微 震 荡 孵 育 过夜;倒去包被液，4 ℃ BSA 封闭振 摇 孵 育 1 h;除 去封 闭 液，TBS 缓 冲 液 ( 50 mmol /L Tris-HCl，150mmol /L NaCl) 快 速 洗 孔 6 次;每 孔 加 入 5. 0 × 1010pfu 噬菌体，室温轻微震荡结合 30 ～ 60 min;弃去未结合噬菌体，0. 1% TBST( TBS + 0. 1% Tween-20)清洗 5 次，200 μL 甘氨酸-HCl，pH2. 2 洗脱特异性 结合噬菌体，重复 2 次. 收集洗脱液，Tris-HCl( pH9. 1)中和. 保留 1 /5 样品，其余用于滴度测定和洗脱物扩增，扩增物用于下轮筛选，共进行 4 轮筛选. 计算 P /N 值( P:靶蛋白结合噬菌体洗脱物滴度，N:BSA 对照蛋白结合噬菌体洗脱物滴度) .
1. 3 噬菌体DNA测序
1. 4 单克隆噬菌体的亲和力反筛测定
筛选获得的含结合肽序列单克隆噬菌体扩增后，按照类似 1. 2 所述方法进行 MMP-14 靶 蛋 白 反筛，计算其 P /N 值，用于测定结合肽噬菌体对 MMP-14 的亲和力，P/N 值越高表示亲和力越强.
1. 5 结合肽序列分析与一致序列获得
利用 Blastp、Clustal X 1. 81 等生物信息软件进行 MMP-14 结合肽 序 列 的 比 对 及 多 重 序 列 分 析，以获得可能的一致序列.
1. 6 一致序列与 MMPs 的分子对接
为了在分子水平预测一致序列对 MMP-14 的靶向性，利 用 Molegro Virtual Docker ( MVD) 和 SwissPDB Viewer 软 件 进 行 了 一 致 序 列 与 MMP-14 及MMPs 家族成员的分子模拟与对接分析. MVD 是最新的一个跨平台对接软件，它提供了对接所需要的所有功能，并且对接结果较为准确，界面容易使用.简单地，首先通过查询 PDB 数据库获得 MMP-14 的三维 结 构 1bqqM，一 致 序 列 短 肽 结 构 模 拟 采 用Swiss-PDB Viewer 软 件，然 后 将 获 得 的 MMP-14 与一致序列三维结构依次 导 入 到 MVD 对 接 软 件 中，经结合区域预测、对接过程设置 等 步 骤，经 过 约 10轮迭代找到能量最 优 的 对 接 模 式 并 得 到 对 接 自 由能、亲和力、作用靶点以及氢键 作用等相关数据.同样方法进行 了 一 致 序 列 与 MMPs 家 族 其 它 成 员的分子模拟对接. 通 过 查 询 PDB 数 据 库 共 获 得 13种 MMPs( MMP1 ～ 3、MMP7 ～ 14、MMP16、MMP 20和 MMP 23 ) 的 已 知 三 维 结 构，对 应 模 板 分 别 为1SU3A、1RTG、1C3IB、2DDY、3DPE、1L6J、1Q3A、1HV5、2W08、1EUBA、1bqqM、1RM8A、2JSD 和2K72.
1. 7 单克隆结合肽噬菌体对金属离子的亲和测定
1. 7. 1 NTA树脂去Ni2+处理 吸取等体积树脂，分装于2支离心管中，TBS 洗涤，其中1支离心管中加入 0. 5 mol /L EDTA ( pH8. 0 ) ，重 复 1 次，再 用0. 1%TBST洗3 次，最后加入TBS，混匀、分 装 为100 μL /管，4 ℃ 保存. EDTA 处和未处理的树脂分别命名为 M － 和 M + ，M 表示金属元素.
1. 7. 2 Hitrap 树脂加Zn2+处理 方法与NTA 树脂处理相似，不同的是 Hitrap 树脂未加载金属离子. 吸取等体积 Hitrap 树脂，加载足够量 Zn2 + (0. 3 mol /LZnSO4) ，离心，依次TBS，0. 1%TBST洗涤，分装和4 ℃ 保存.
1. 7. 3 单克隆结合肽噬菌体的Zn2+亲和测定 分别以加载和未加载 Zn2 + 的 Hitrap 树脂为阳、阴性处理，取 M + 、M － 树脂Ep 管各1支，加入 BSA 封闭培养1h，弃上清，加入 5 × 1010pfu 扩增的单克隆噬菌体结合培育 1 h，弃上清，0. 1% TBST 洗涤，0. 2 mol /L 甘氨酸-HCl 洗脱 2 次，合并 2 次洗脱液，测定噬菌体滴度，计算 P /N 值( 金属离子螯合树脂噬菌体洗脱滴度 /未加载金属离子螯合树脂的噬菌体洗脱滴度) . Ni2 + 树 脂的亲和力测定方法类同 Zn2 + 树脂测定.
1. 7. 4 单克隆结合肽噬菌体的Ni2+亲和测定 方法同1. 7. 3，以加载和未加载Ni2+的NTA树脂为阳、阴性处理.
1. 8 单克隆结合肽噬菌体与细胞结合的免疫荧光检测
MG-63细胞复苏、培养按常规操作 ( 含 10%FBS 的 DMEM，2 mmol /L谷氨酰胺，100 U /mL青 霉素和 100 μg /mL链霉素于37 ℃ ，5% CO2 的 FORMACO2 培养箱中培养) ，在6孔板中制备 MMP-14 诱导表达和未诱导表达的MG-63细胞，然后加入扩增的单克隆噬菌体，经孵育、洗涤，细胞固定等步骤后，加入鼠抗M13单抗( Amersham Biosciences 公司) ，经结合、洗涤等步骤，加入FITC标记羊抗鼠二抗 IgG，甘油封片，Olympus荧光显微镜下观察噬菌体与细胞表面分子的结合水平，并计算荧光率.
1. 9 合成多肽对MG-63 细胞活力的体外MTT测定
MG-63 细 胞 复 苏、培养按常规操作，配 制 5 ×104 个 /mL 细胞悬液，于 96 孔 板 中每孔加 100 μL，5% CO2 培养箱中培养 24 h 贴壁后，依次加入不同浓度的合成多肽(0. 1，1，10 和 100 μg /mL)继续培养72h 后，每孔加入 20 μL MTT(5 mg /mL) ，继续培养4h后吸尽上清，再加 入 DMSO 150 μL，振荡10min，使其充分溶解，酶标仪测定 490 nm 波长处的吸光度，计算细胞生长抑制率.
抑制率 = (1-加药组的平均A值 /对照组的平均 A 值) ×100% ，重复3次.
2 结果
2. 1 靶向MMP-14的噬菌体随机肽库筛选
以MMP-14蛋白催化结构域为靶标，经过4轮噬菌体随机12肽库筛选，噬菌体得到富集，洗脱噬菌体的滴度结果见 Fig. 1，可见噬菌体随着筛选轮数的增加而逐渐得到富集，其噬菌体滴度从第1轮的3. 8×103pfu /μL升至 第4轮的5. 3 × 104pfu /μL;同时在1～3轮中，其P /N 值也随着筛选轮数的增加而提高，见 Table 1.
2. 2 靶向 MMP-14 结合肽序列的确定及亲和力反筛测定
2. 3 MMP-14 结合肽序列的同源比对及一致序列确定
对筛选得到的 MMP-14 结合肽序列在 NCBI 进行 GenBank Blast 搜索，未发现其他生物体存在同源序列. 所有多肽序列经经验分类后进行Clustal X1. 81多重序列比对，结果发现存在可能的一致序列AHQLH、HHXH、L / IE PLL / I(X 代表任意氨基酸) ，见Fig. 2，专利申请号:200910161829X［12］.
2. 4 一致序列多肽与 MMP-14 的分子模拟对接
为进一步预测和确定一致序列对MMP-14的专一性，采用类似的方法就 AHQLH、HHTH、LPLL 等 3条一致序列对 PDB 数据库中已解析三维结构的 14种 MMPs ( MMP1-3，MMP7-14，MMP16，MMP 20，MMP 23)进行了分子对接. 结果发现:一致序列可与MMP7-8，MMP12-13 和 MMP20 等5种MMPs 家 族成员的催化结构域对接，而与其它8种 MMPs 家族成员则对接无效. 这可能与这5种MMPs 的基本结构有关:MMP7 有 着 最基本的结构域，而其它4种MMPs 有着标准的结构域［13，14］. 3 种一致序列对接和能量变化等见 Fig. 4 和 Table 4.
2. 5 单克隆噬菌体对金属离子的亲和能力
2. 6 单克隆结合肽噬菌体对 MMP-14 在细胞水平的靶向性
SABC-FITC 免疫荧光检测单克隆结合肽噬菌体C3-5、C3-52 与 MMP-14 诱导和非诱导表达的MG-63细胞的结合水平，结果见 Fig. 5. 可见与对照相比，2种噬菌体与MMP-14诱导表达MG-63 细 胞 的 荧 光强度明显高于对照细胞，其诱导细胞的荧光率明显高于未诱导细胞，见 Table 6.
2. 7 一致序列多肽对 MG-63 细胞活力的抑制作用
采用MTT方法检测 合 成 的 一 致序列多肽 对MG-63 细胞活力的抑制作用，共合成和测定了2 条多肽序列 AHQLH 和 LPLL，结果见 Fig. 6. 可见随着合成多肽浓度的增加，其对细胞的抑制作用逐渐增强，呈现出明显的剂量依赖关系. 其中 AHQLH 在浓度为 10 μg /mL 下 对细胞的抑制率即 可达到41. 6% .
3 讨论
近 20 年来，基于 MMPs 的多种抗肿瘤抑制剂先后进入临床试验，但大多因药物副作用大 /选择性差而在临床试验的Ⅱ、Ⅲ期被否决. 其中的一个重要原因是因为这些抑制剂具有广谱的特异性，不仅抑制了靶酶，也抑制了一些有益酶［15］. 迄今为止，只有 1个基于 MMPs 的 Doxycycline 通过 FDA 认证.
考虑 MMP-14 被认为是与肿瘤发生关系最密切的一种 MMPs，我们选择 MMP-14 为靶标进行噬菌体随机肽库的筛选与研究，期望通过噬菌体随机十二肽库筛选和分子模拟、细胞 in vitro 等研究确定高效和专一性的 MMP-14 抑制剂，从而用于靶向 MMP-14先导药物的研发. 以 MMP-14 催化区蛋白为靶标的噬菌体随机肽库筛选，我们得到了噬菌体的富集，但总体 P /N 值较低( < 8) ，且第4轮低于第3轮，而在第5轮 P /N 值也未有提高(资料未发表) ，为此我们选取了第3、4 轮的富集噬菌体进行测序，考虑第4 轮的多肽已含多个His，而我们前期的研究已经明，His 的存在对 包 括 Zn2 + 在内的多种金属离子强的亲和力［11，16］，显然含多个 His 的序列特征不适宜作为 MMPs 的专一性抑制剂. 为此，我们对第 3 轮富集的噬菌体进行了大量的测序. 如我们所期望，获得了多条含一致序列的多肽，多肽序列所含 Ala、Leu 等氨基酸 与 MMP-14 底物蛋白的相似性，也 揭示本筛选结果的可靠性，更且令我们兴奋的是，通过亲和力反筛，得到了多条高P/N 值 的结合肽，其最高单条噬菌体亲和力达到 4024. 39，远高于该轮的富集倍数( P /N = 7. 93)
为了进一步预测和确认所得到的一致序列与MMP-14 是否存在相互作用以及确定在 MMP-14 上相互作用的结构域，我们采用计算机分子模拟与对接和细胞免疫荧光两种方法进行了相关分析. 包括催化结构域、类血红素结构域在内的 MMP-14 蛋白的多个区域以及多种 MMPs 家族成员三维结构的完全解析，为我们进行精确的分子对接提供了巨大的方便与基础. 我们从初步确定的一致序列中选取了3 条短肽(AHQLH，HHTH，LPLL) 进行了其与 MMP-14 的计算机分子模拟与对接，对接结果一方面进一步确认了 3 条一致序列与MMP-14有效结合，而且确定了其分子对接位点在MMP-14 催 化 结 构 域 的His-Asn-Glu 位点，与HX对接的不成 功，从另一角度证明了筛选获得的一致序列多肽与MMP-14 催化结构域的专一 性结合作 用，同样也证明了我们以MMP-14的催化结构区为靶标随机肽库筛选的准确性. 不尽人意的是，该3条一致序列与 14 种已解析三维结构的 MMPs 中的 5 种MMPs 也能够有效分子对接，提示我们需进一步的优化该 3 条一致序列以提高其对MMP-14 的专一性. 进一步的在细胞水平的免疫荧光检测也确认结合肽噬菌体与MMP-14 的有效结合. MG-63 细胞的一个重要特征是在雌激素的诱 导下可以过量表达MMP-14 ( 实 验 数 据 未发表) ，通过诱导和非诱导表达 MG-63细胞的免疫荧光检测，我们在细胞水平确认了单克隆结合肽噬菌体是通过结合肽与细胞表面诱导表达的 MMP-14 的结合而发挥作用的. 另外，分子对接结果同时还揭示，我们筛选获得部分多肽可能还与金属离子具有靶向结合作用，为此，我们进行的金属离子亲和力测定确认了该种作用，确认部分一致序列具有 MMP-14 和 金属离子双靶向的作用. 这是非常重要的发现，因为现行研发的靶向 MMPs 的抑制剂大多 是 在抑制分子结构的基础上偶联金属离子螯合剂而形成［1］，一致序列的金属离子亲和特征可以避免金属离子螯合剂的使用而可望在降低毒副作用方面发挥重要作用.
在以上工作的基础上，我们就筛选一致序列进行了初步的细胞活力 抑 制 测定，考虑多聚His 短 肽对金属离子广谱的亲和特性，显然不宜作为靶向先导多肽药物. 为此，我们合成了 AHQLH，LPLL两条短肽，初步的体外细胞抑制研究证明所测定的两条短肽对 MG-63 细胞具有一定的细胞活力抑制作用，但与期望作为先导药物浓度仍存在较大差距，进一步的短肽优化与改造仍在进展中.
4 主要结论
免责声明：本文为行业交流学习，版权归原作者及原杂志所有，如有侵权，可联系删除。文章标注有作者及文章出处，如需阅读原文及参考文献，可阅读原杂志
